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1、柑桔属柠檬类果实果胶酯酶的活性分析摘要:果胶酯酶(PE或PME)能催化果胶脱酯生成低酯果胶和果胶酸,属于一类果胶酶,广泛应用于食品特别是果品加工工业中。以新鲜柠檬为原料,采用NaCl-冷冻离心-盐析的方法提取柠檬果实中的果胶酯酶,pH-stat法对果胶酯酶进行活性分析。研究温度、pH、相对储藏度等因素对柠檬类果实果胶酯酶的活性影响,并探索该酶的最适温度、最适pH值,进而研究该酶的热稳定性;对柠檬果实中果胶含量进行测定。实验表明:58℃,pH=6.90时柠檬中的果胶酯酶的活力最高。关键词:果胶酯酶;柠檬;活性果胶酯酶(p
2、ectinesterase)(缩写PE1,1,11),国际酶委员会将果胶酯酶归类为果胶—果胶酰基水解酶。它能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇,通过去除果胶分子链上的半乳糖醛酸羧基上的酯化基团(主要是羟甲基或羟乙基),增加果胶在水中的溶解度;所产生的果胶酸在Ca2+等离子的桥联作用下,使细胞间的黏合加强,从而容易形成凝胶。因此,果胶酯酶常用于制备低甲氧基果胶以及用于果汁加工澄清等技术中。另外,果胶酯酶还能够提高食品粘度、延长货架期[1]、脱苦、去除异味和水果果皮等,有研究发现,果胶酯酶与植物病毒运动蛋白之间有相互联系[2-
3、3]。果胶酯酶在食品工业中有着极其重要的作用和开发前景。它广泛存在于一些植物如番茄、桔皮、苹果、葡萄、香蕉、梨、马铃薯、柠檬、向日葵、大豆、烟草等以及一些细胞壁降解的微生物如细菌、真菌等中。柠檬在植物学中属柑橘属类,柠檬中含有大量的果胶酯酶,它与细胞壁结合紧密,主要存在于柠檬的皮、白皮层以及汁胞细胞中[4]。我国盛产柠檬,但对柠檬皮渣的利用不够重视。柠檬皮渣不但是提取果胶的最佳原料[5],同时也是果胶酯酶的良好来源。本文对柠檬皮及果肉中的果胶酯酶进行了生物学特性分析,为果胶酯酶在食品工业中的应用提供依据,同时充分利用柠
4、檬皮渣,变废为宝,还可有效地保护生态环境。1.1材料与试剂新鲜柠檬:市售;果胶(JCO1高酯果胶):宜昌金川生物科技公司;氢氧化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸等试剂均为分析纯。1.2仪器1材料与方法ZD-2型自动电位滴定仪:上海精密科学仪器有限公司;JJ-1型增力电动搅拌器:江苏省金坛市医疗仪器厂;DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱:上海益恒实验仪器有限公司;JJ-2(2003-61)组织捣碎匀浆机:常州国华电器有限公司;冷冻离心机(Centrifuge5810R):Eppendorf.Inc.USA.等1.3方法
5、1.3.1粗酶液的提取将柠檬果肉掰瓣,捣碎均质,加入2倍量的1mol/LNaCl溶液,盐提。搅拌1h后4℃冷冻离心(5000g,20min),过滤得上清液,然后用饱和度为75%的(NH4)2SO4饱和粗酶液,离心沉淀即得到较纯净的酶液。4℃下保存备用。(柠檬皮则是洗净后切成小块,捣碎均质,加入4倍量的1mol/LNaCl溶液,盐提。之后处理方法和果肉一致)。1.3.2PE活力的测定果胶酯酶催化水解果胶分子而释放出H+,使反应体系的pH下降,用碱液(0.05mol/LNaOH溶液)使反应体系的pH始终保持在7。通过碱的消
6、耗量可以反应出果胶酯酶的活性。测定方法:一定温度条件下,取30mL1%的柑橘果胶溶液于100mL三角烧瓶中,用0.05mol/L的NaOH调pH到7后,加入10mL粗酶液,同时开始记时,通过自动电位滴定仪用0.05mol/LNaOH滴定,保持溶液的pH=7。以反应的NaOH微摩尔数—反应时间作图,由所得曲线最初部分的斜率表示果胶酯酶的活力,PE活力单位为mol/s,即每秒钟消耗1molNaOH定义为一个PE活力单位。1.3.3温度对酶活性的影响1.3.3.1PE最适温度的确定分别在30、40、50、60、70℃下测定P
7、E活力,作活力-温度曲线图。1.3.3.2pH对酶活性的影响在最适温度下,分别于不同pH条件测定PE活力,作活力-pH曲线图。1.3.3.3PE热稳定性研究将PE酶液分别在50℃、55℃、60℃、65℃温度下分别保温,每隔15min取样测定酶残余活力,作活力-时间曲线图。1.3.3.4相对储藏度对酶活力的影响将同一批柠檬储存在冰箱的保鲜柜(5℃)中,每隔5d进行一次酶活测定,作活力-时间曲线图。1.3.3.5柠檬果皮和果肉中PE活性比较分别从柠檬果皮和果肉提得粗酶液,在最适温度和最适pH条件下测定PE活力。2实验结果与
8、分析2.1温度对PE活力影响通过测定不同温度(25、30、40、50、60、70℃)下PE活力,得到活力-温度曲线图(见图1)。由图1可以看出,在25℃~70℃条件下分别测得柠檬果皮、果肉的PE活力明显不同。随着温度的升高,PE活力呈现明显的上升趋势,在58℃时,PE活力达到最大,当高于58℃时,PE活力下降。由此,可以推断该PE
