果胶酶活性测定实验报告

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1、一、实验设计实验序号实验三实验名称特定产物工业生产菌种发酵试验时间2010年13日-23日实验室基础生物2（121）一、实验目的1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、实验与原理1、果胶酶概况（1）、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数

2、来自霉菌。（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。2、果胶酶的酶活测定方法（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。（2）、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。（3）、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。（4）、还原糖法（DNS法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法

3、在540nm进行测定。3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：（1）、培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子（2）、培养条件：温度、pH、溶解氧等（3）、附加条件：诱导物、表面活性剂等4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂三、设备与材料（一）、培养基1、菌种筛选使用培养基（1）、基本培养基:果胶1%、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、琼脂2.0%。（2）、分离培养基：果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%、H4.5。（3）、发酵培养基果胶1%、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5。2、黑曲霉Asp

4、-2固体发酵培养基菌种斜面培养基（查氏培养基）：NaNO30.2%、K2HPO40.1%、KCl0.05%、MgSO40.05%、FeSO40.001%、蔗糖3%、琼脂2.5%、自然pH。3、种子培养基：麸皮3.0%、橘子粉2.0%、硫酸铵0.5%、葡萄糖1%、KH2PO40.1%、pH4.5。4、固体发酵培养基：麸皮10g、橘子粉2.5g、(NH4)SO40.1g（0.8%干料计）、葡萄糖0.125g（1%干料计）、水15ml。（二）、试剂1、酶活测定使用试剂（1）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652g，柠檬酸钠7.5g，溶解定容至1000ml，用0.1

5、MNaOH或0.1MHCl调节pH至3.0。（2）、底物——0.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用上述缓冲液溶解，在电炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于4℃，7天内有效。（3）、DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g、溶解于500mL水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3-5二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，无水硫酸钠5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容至1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7~10天后过滤使用。（三）、仪器（1）、烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；（2）、天平、

6、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。四、实验方法步骤（一）、果胶酶产生菌的分离——稀释涂布平板法1、菌种的采集要获得产生果胶酶的菌种，可从富含果胶酶作用底物的场所去采集。胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛果胶酶时，只要到相应的环境中采样即可。（果树下面的土壤里）2、倒平板配制分离培养基高压灭菌30min冷却至约50℃倒5～6块平板/100mL冷却备用3、制备土壤稀释液（1）称取土样10g，放入90mL无菌水中（带玻璃珠），摇动10min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液；（2）用无菌吸

7、管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到10-2土壤稀释液；（3）再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液；（4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。4、、涂布用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。5、富集培养采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。培养时控制培养的温度、p