荧光定量pcr探针设计 定量pcr taqman探针设计要领

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2、NNNNN发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’互补发表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNN料染3’←MAF5’3’←5’TaqmanprobeforwardprimerTaqmanprobeforwardprimer三引物的设计1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时

3、，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5个bp保守。5’NNNNNNN3’20发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’NNNNNNNNN5’2．上下游引物的长度和Tm值上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重

4、复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。上游引物应标记F(forword)，且在基因组的位置及长度；下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。用oligo或primerpreiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃，长度相差最好不超过4bp。3．引物的评价用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“createprimercatalog”，在“nam

5、e”中输入引物的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primerself20dimer”,分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dimer，并对此引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primerhairpins”,分析引物的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的hairpins进行评价。再选择所需要的上下游引物，在“report”

6、菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好(dG值通常为负值)，绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行)。不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。4．上下游引物与探针的距离(上下游引物的位置)理论上讲，上游引物的3’端离探针的5’端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的

7、3’端离探针的3’端为4bp；下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3’端离探针的3’端最为15-150bp。整个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过200bp。5．简并引物的设计20当为了能够同时扩增即使在引物位点也有突变的目的片段，若多个碱基出现的概率相同，就要在此位点，设计一个代表多个碱基的简并子。在合成引物时，在合成到此位点时，就不是加入一个碱基，而是同时加入简并子所代表的多个碱基。这样，实质合成的引物是多条引物，只不过是在简并子位置碱基不同而已。但简并引物要考虑每条引物的Tm值，

8、确保简并子所代表的不同碱基的不同引物Tm值相差不超过2℃。若超过2℃，在确保引物的3’端引物相同时，在Tm值较低的碱基引物的5’端加入几个碱基，使其的Tm值相同。但这时就不是简并引物，而是分别合成长度不同，简并子位点碱基不同，但Tm值相同的两条引物，最后在进行等浓度的混合即可。5’→3’NNNANNNNNNGNNN序列：5’-NNNNNNNNNA/GNNNN