定量PCR-Taqman探针设计要领教学提纲.docx

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1、定量PCR-Taqman探针设计要领精品文档定量PCRTaqman探针设计要领自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且

2、也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。 一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。　 第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个co

3、ntig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。　 第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则：1、先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。·收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档2、所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温

4、度。·3、扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。·4、保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。·5、为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）6、将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。引物设计原则·1、序列选取应在基因的保守区段·2、避免引物自身或与引

5、物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构3、典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。4、Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%·5、引物之间的TM相差避免超过2℃·6、引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的

6、碱基·7、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。8、Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp   9、引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档探针设计原则1、探针位置尽可能地靠近上游引物  2、探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性  · 检测探针的DNA折叠和二级结构   3、Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%  4、探针的5’端应

7、避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。   5、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。   6、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。   TaqmanMGB探针设计1、探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。  2、Tm值应为65-67℃。   3、 尽

8、量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。  4、尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。   · 原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档注意：为了满足上述要求的4