PCR和定量PCR的引物和探针设计

《PCR和定量PCR的引物和探针设计》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、引物和探针设计–PCR和定量PCR目录基本原理1引物设计的重要因素2针对特殊应用的其他提示4引物的质量和纯度7基本原理基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。这个3'-羟基由相配的引物提供。引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。通过选择特异的引物序列，DNA片段的所需区域可得到扩增。对于大多数PCR

2、反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP)1引物设计的重要因素引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。最流行的软件为Primer3(http://primer3.sourceforge.net)，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。引物长度和专一性典型的引物长度为18-30个碱

3、基。短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR产物量低下。应避免编码单一序列和重复序列的引物。平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%和60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。退火温度退火温度是基于引物的解链温度（Tm）计算。最常用的解链温度计算公式显示如下。“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基

4、）有效，该法则提出每个AT对能将双链DNA的解链温度提高2°C，每个GC对则能提高4°C。Tm=2°C•(A+T)+4°C•(G+C)GC法则（适用于长于13个碱基的序列）也是一种简单但同时相当不准确的方法。(G+C-16.4)Tm=64.9°C+41°C•(A+T+G+C)两种法则都假设退火发生于以下标准条件下：50nM引物、50mMNa+和pH7.0。“盐调整”法稍微准确一些，考虑到了反应缓冲液中的Na+离子浓度。C+G820+Tm=100.5°C+41°C••16.6•log10([Na])A+C+G+TA+C+G+T最复杂的方法称为“碱基堆积”法。这里的计算中包

5、括了杂交期间的焓（H）和熵（S）。计算出的解链温度可用于估算最佳退火温度。但是，经常需要经验性地估算最佳温度。提示所选引物的解链温度应允许退火温度介于55°C和65°C之间。一个引物对的两条引物都应具有相同或极相近的解链温度。2引物设计的重要因素避免互补的引物序列引物设计应避免一条引物内的互补性超过3个碱基。如果不遵循这个法则，那么可能出现使引物不能与其目标序列结合的二级结构。引物之间的同源性也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3'端。同源性将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR反应竞争资源，导致PCR效率降低，在极端情况下，甚至导致完全无特异性PCR产物

6、生成（图1）。A5’ACGGATACCATGCCTATG3’5’ACGGATACCATGCCTATG3’B5’ACTTGCATGTCTAGTCAC3’3’CAGTGAGTTACATGACTG5’图1因一条引物内（A）和两条引物之间（B）的互补性而形成引物二聚体。3’-序列应小心避免在退火步骤期间将PCR引物的3'端错配。3'端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。3针对特殊应用的其他提示针对特殊应用的其他提示逆转录(RT-PCR)对于RT

7、-PCR，例如基因表达分析，推荐采用mRNA特异性引物对，以避免或识别基因组DNA扩增。可选择两种方法（图2）。首先，引物可设计用于在内含子序列前后两个不同的外显子之间结合（图2A）。在这种情况下，所产生的基因组DNA来源PCR片段将远大于mRNA来源者。根据内含子的长度，可以缩短聚合时间，这样将不会合成长片段。但是，基因组DNA的扩增会消耗资源，从而降低所需要的mRNA扩增的效率。另一个推荐方法是设计跨越mRNA上外显子-外显子联合而结合的引物。这可以预防基因组DNA的扩增（图2B）。APCRproductIntron1GenomicD