荧光定量PCR引物设计

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1、荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beaconDesigner有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GCbuffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好内参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，（1）设计的时候尽量靠近基因的3'端

2、，这样能最大限度地保证扩增效率（2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染（3）两条引物的Tm值不要相差太大（4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上（一般Tm=80以下的峰都是引物二聚体），对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。（3）

3、相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtimePCR的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的3'端不要有错配。（5）一般我们用PrimerPremier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之内可以搞定一个基因。实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用

4、DNAMAN，Alignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。5、碱基要随机分布，尽量均匀。6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。8、引物5‘端可以修饰。9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GCrich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。10、引物3'端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5'端大于3‘端。12、定量产物长度80-150bp最好，最长是3

5、00bp。实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：　　（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本

6、进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。　　（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。　　（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。　　（4）内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。　　（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，

7、同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。　　在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。　　所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧

8、光扩增曲线。　　PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：　　（1）RGreenI检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获