实时荧光定量pcr原理和引物设计说明书

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1、逆转录-实时荧光定量PCR（RT-）qRT-PCR（RT-）qRT-PCR（Reversetranscription）quantitativerealtimePCRRT-PCRReversetranscription-PCRReal-timePCR样品处理RNA提取及逆转录qPCR数据分析样品处理细菌样品收集1-5*109细菌，置于液氮研磨，加入1mLTrizon，混匀，高温（55℃）细胞样品收集1-5*107细胞，加入1mLTrizol，混匀，进行RNA提取或者放置于-80℃冰箱动物样品取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5mL离心管中，加入1mlTrizol

2、充分匀浆。RNA提取及反转录将处理好的样品置于室温，静置5min加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置5min4℃离心，12000g×15min，取上清加入等体积异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min4℃离心，12000g×10min，弃上清加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。RNA提取及逆转录注意事项样品量和Trizol的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。实验过程必须严格防止RNase的污染。DNase（RN

3、ase-free）RRI（RecombinationRNaseInhibitor）RNA提取及逆转录RNA质量检测（完整性与纯度）RNA提取及逆转录反转录注意事项RTPrimer的选择OligodT，随机引物，基因特异性引物gDNA污染RNA提取及逆转录❌qRT-PCR（实时荧光定量PCR）化学原理数学原理标记方法定量分析方法与常规PCR技术比较常规PCR对扩增终产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测。qRT-PCR的化学原理qRT-PCR的化学原理起点定量：起始DNA量是样本中原来的DNA量，更有意义，重现性好，误差小。终点定量：终点DNA的量是经过PCR放大

4、的量，存在部分“失真”，并非研究所期望的数据，误差大。qRT-PCR的化学原理典型的PCR扩增四个阶段qRT-PCR的化学原理三个概念基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。荧光域值（threshold）的设定：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。qRT-PCR的化学原理三个概念Ct值：C(Cycle)，t（threshold）表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的Ct值

5、与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。qRT-PCR的数学原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)log(1+Ex)*Ct=-log

6、X0+logM(4)Ct=-logX0+logM(5)log(1+Ex)Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量qRT-PCR的数学原理qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记SYBRGreenIEthidiumBromide特异性荧光标记Taqman探针TaqmanMGB探针分子信标qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记SYBRGreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的原料。qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记SYBRGreenI作用原理qRT-PCR的标记方法非特

7、异性荧光标记SYBRGreenI标记注意事项SYBRGreenI与任何dsDNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或者引物二聚体的生成，也将同时被检测，从而导致检测结果不准确。设计合适引物，防止非特异性扩增。反应结束后必须做熔解曲线分析。qRT-PCR的标记方法非特异性荧光标记熔解曲线对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致