实时定量pcr引物和探针设计操作步骤primerexpress软件

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1、word文档整理分享实时定量PCR引物和探针设计操作步骤PrimerExpress软件PrimerExpress是实时定量PCR引物和探针设计的专用软件。遵守以下三个原则有助于快速建立定量PCR反应体系：1.所有扩增按照同样的原则设计(PrimerExpress)；2.所有PCR反应在ABIPRISM?7000/7900上使用同样的热循环条件；3.所有反应使用相同的PCR试剂。引物和探针的设计原则下述原则的重要程度由上往下越来越低，请尽量满足编号靠前的条件。它们中有的已经在PrimerExpre软件中设置成缺省值，有的则需要在选择

2、引物和探针时由设计者加以运用。如果是设计SYBRGreen引物，也要选择TaqManPrimerandProbedesign并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。TaqMan探针：1.保持G-C含量在30-80%之间。2.避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。3.5'end不能是G。4.尽量使探针中的Cs多于Gs。如果不能满足，则使用互补链上的探针。5.对于单探针反应，用PrimerExpress?软件计算出来的Tm值应当在68-70°C之间。引物：1.在探针确定以后再选择引物。2.引物要尽可能地接近探针，但是

3、不要重叠。3.保持G-C含量在30-80%之间。4.避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。5.用PrimerExpress?软件计算出来的Tm值应当在58-60°C之间。6.3'end的5个碱基中Gand/orC碱基的总数不能超过2个。实时TaqMan引物和探针设计BeginbyopeningPrimerExpressandselecting"File","New",and"TaqMan?Primer&ProbeDesign".Thefollowingscreenwillappear.YoucanclosetheTa

4、qMan?Primer&ProbeDataboxasshown.参考资料word文档整理分享输入或插入序列Importorpasteasequenceintothewindow(Importshown).TopasteasequencefromaWordortextfile,firstcopyittotheclipboard.Besuretoonlyselectthesequence(includingnumbersorannotationsisOK);donotincludeextraneousinformationsuchas

5、accessionnumbersetc.Next,select"Edit"and"Paste".ThesequencewillappearintheSequencescreenofPrimerExpress.Or,toImportaSequence,clickthe"ImportDNAFile"buttonasshown.Thesoftwarewillthenaskyoutolocatethesequencefile.Selectitfromafolder,harddrive,disk,ordesktop.Again,noanno

6、tationsshouldbepresentinthissequence.参考资料word文档整理分享Afileisthenimportedafterselectingthefilelocation.保存输入的序列Select"File"and"Save"togivethesequenceaname.ThiswillbedisplayedintheFileNameBoxandwillsavethesequenceintheArchiveFolder.参考资料word文档整理分享引物和探针设计参数Clickthe"Parameter

7、s"tab.ThisdisplaystheUniversaldefaultparametersusedtosearchforsuitableTaqMan?primer&probesetsforreal-timeassays.Itisstronglyrecommendedthatyoudonotadjustanyoftheparameters.参考资料word文档整理分享引物和探针的排序及选择PrimerExpressisnowreadytofindPrimersandProbes.Clickthe"Primers"tab,sele

8、ct"Options"and"FindPrimers/ProbesNow".Thesoftwarewilldisplaytheprogressinthesmallwindowbelowthesequence.**Pleasedisregardthe