实时荧光定量PCR详细操作步骤.doc

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1、实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。反转录反应条件如下。37°C15min（反转录反应）85°C5sec（反转录酶的失活反应）RealTimePCR反应选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。基因引物序列扩增片段长度NR2BN

2、R2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213bpNR2B(–)ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18srRNA18srRNA(+)TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198bp18srRNA(–)CGTTTATGGTCGGAACTACGA1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqTM（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1μl0.4μMPCRReversePrimer（10μM）1μl0.4μM模板（c

3、DNA溶液）0.5μldH2O10μlTotal25μl全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18SrRNA。4管BDNF或者18SrRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5μl。2）三步法PCR首先95°C作用3min。PCR进行35个循环。步骤温度时间变性95°C30秒退火58°C30秒延伸72°C30秒融解曲线温度时间变温速度95°C0秒20°C/秒55°C15秒20°C/秒95°C0秒0.1°C/秒