分子信标-taqman探针法实时荧光定量pcr新型探针及-生物技术通报

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1、生物技术通报·技术与方法·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2016,32(11):107-114分子信标-TaqMan探针法实时荧光定量PCR新型探针及引物1，32211，3姜文灿 岳素文 江洪 葛素君 王成彬（1.中国人民解放军总医院临检科，北京100853；2.北京泰格瑞分子检验有限公司，北京100085；3.温州医科大学检验医学院生命科学学院，温州325000）摘要：在TaqMan探针法实时荧光定量PCR中，排除由引物探针聚合延伸引起的假阳性问题以及由引物二聚体（PrimerDimer，PD）引起的假阴性问题。首先对不同探针进行引物探针聚合实验；然

2、后通过双重PCR的干扰实验选择合适的内标基因，并使用内标质粒检测验证中部同序引物排除PD干扰的实用性；最后比较探针法不同体系检测HBV基因的灵敏度。结果表明，引物与探针聚合实验中，含有反义碱基的HBVP4在重复实验中未出现假阳性；竞争性双重PCR和非竞争性双重PCR两模板开始出-9-8现干扰作用的浓度差分别为20倍和100倍；对于内标基因，使用中部同序引物对以及普通引物对分别可以检测到10和10稀释度；3种HBV基因检测体系，使用普通引物对可以检测到Ct33左右，加入内标系统和使用中部同序引物对均可检测到Ct35左右。在TaqMan-分子信标结构调整的基础上引入反

3、义碱基可以在排除由引物和探针聚合延伸引起的假阳性问题；在探针法中，使用中部同序引物对和加入内标系统均可降低PD的干扰程度，提升检测的灵敏度。关键词：实时荧光定量PCR；TaqMan探针；反义碱基；引物二聚体；内标系统DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.029NewProbeandPrimerforMolecularBeacon-TaqManRealTimeFluorescentQuantitativePCR1，32211，3JIANGWen-canYUESu-wenJIANGHongGESu-junWANGC

4、heng-bin（1.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine，ChinesePeople’sLiberationArmyGeneralHospital&PostgraduateMedicalSchool，Beijing100853；2.BeijingTagArrayMolecularTestCo.，Ltd，Beijing100085；3.CollegeofLaboratoryMedicineandLifeScience，WenzhouMedicalUniversity，Wenzhou325000）Abstract:Ourpur

5、poseistoeliminatethefalsepositiveproblemcausedbyprimer-probeaggregationandextension，aswellasthefalsenegativeproblemcausedbyprimerdimer（PD）.First，theprimerandprobeaggregationresultsweretestedfordifferentprobes；thentheappropriateinternalcontrolgene（IC）wasselectedbasedonthecompetitiveint

6、erferenceexperimentsofduplexPCR，simultaneously，thepracticabilityofcentral-homeprimerexcludingtheinferenceofPDwasverifiedontheplasmidoftheIC；andfinally，thesensitivitiesofdifferentsystemsforTaqManmethodwerecompared.TheprobeHBVP4，containinganantisensebase，didnotproducefalsepositiveresult

7、sintherepeatedtrials；theconcentrationdifferenceatwhichinterferencesforthetemplatesofcompetitiveandnon-competitiveduplexPCR-9werenoticedwas20timesand100times，respectively.Thedilutionthatcoulddetectedbycentral-homeprimerandcommonprimerwas10-8and10，respectively.Andfor3HBVgenedetectionsys

8、tems，