实时荧光taqman 探针设计

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1、一、实时荧光Taqman探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-timePCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。若在

2、原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。另real-timePCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大

3、，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有TaqmanMGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。3．探针的名称应

4、标记探针在基因组的位置及长度。4．探针Tm值计算用oligo或primerpreiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。5．探针的评价用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“createprimercatalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primerselfdimer”,分析探针的二聚

5、体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primerhairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的hairpins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pairdimer”进行分析。6．探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。7．Taqman探针与引物之间的位置Taqman探针应

6、靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。如：forwardprimerTaqmanprobe5’→3’5’FAM→3’染料NNNNNNNNNNNNNN发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’互补发表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNN3’←5’reverseprimer或

7、：reverseprimer5’→3’NNNNNNN发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’互补发表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNN料染3’←MAF5’3’←5’TaqmanprobeforwardprimerTaqmanprobeforwardprimer三引物的设计1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同

8、的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3