资源描述：
《猪圆环病毒pcr检测方法的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、猪圆环病毒PCR检测方法的建立澎江廖种学2009年第4期猪圆环病毒PCR检测方法的建立王东方.,魏战勇.,崔保安,陈红英,郭小参,吕晓丽,管倩(1.河南农业关学牧医工程学院,河南郑州450002;2.河南省动物性食品安全重点实验室,河南郑州4500023.河南省动物疫病预防控制中心,河南郑州450o08)摘要:本研究建立了检测猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究.该方法具有快速,敏感,特异性强等特点,从PCV2感染的细胞中可最低扩增到0.1ng的DNA,且对其它病原微生物如PRV,PPV不
2、能检出.可对病料,血清提取DNA进行检测,所有程序在5h内得出结果.该方法可用于PCV2感染猪的快速诊断,引种检疫,分子流行病学调查.关键词:PCR;检测;猪圆环病毒中图分类号:$859.81文献标识码:B文章编号:0528—9017(2009)04.0812.04猪圆环病毒(porcinecireovirus,PCV)是迄今为止发现的最小的一种脊椎动物病毒.根据PCV的致病性,抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCV1和PCV2两个基因型.PCV1广乏存在于猪体内及猪源代细胞系中,无致病性,不能引起细胞病
3、变;PCV2具有致病性,主要引起一种新发现的传染病——断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyderome,PMWS).PMWS主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征,已给全球养猪业造成相当严重的经济损失.据报道,1991年PMWS首发于加拿大;目前世界其它地方普遍有PMWS发生的报道.在我国,郎洪武等首次报道我国猪群存在PCV2感染以来,已陆续有二十几个省,自治区,直辖市报道有猪圆环病毒的感染一.对于该病诊断已有病毒分离,免疫荧光法,ELISA方法,
4、免疫组化法等方法.这些方法操作烦琐,困难,经常受到条件制约,原位杂交等.目前广泛应用的PCR具有较高的敏感性和特异性.然而由于不同的引物之间差别较大,以及PCR扩增时各种因素的影响,使得PCR方法的特异性和敏感性各不相同,因此用于诊断时往往容易出现假阴性的结果.我们针对最常见的3种扩增PCV2的引物区域设计,比较了对引物的特异性和敏感性,优化了PCV2的PCR,诊断方法,建立了检测与诊断猪圆环病毒的PCR方法.这将有助于我国猪群PCV2疫情的监测,也能为控制该病的传播提供技术支持.1材料和方法1.1试验
5、材料PCV2为中国农大杨汉春教授惠赠,猪细小病毒(PPV),伪狂犬(PRV)均为本室保存之毒种.PK15细胞(无PCV1污染)为本室保存.DMEM购自华美生物工程公司;葡萄糖胺购自Sigma公司;无菌胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司.pGEM—Teasy载体购自Promega公司,TaqDNA聚合酶,dNTPs,Mg2,MarkerDL2000购自TaKaRa公司,异硫氰酸胍(GuSCN),饱和平衡酚,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),氯仿:异戊醇(24:1)等均购自上海Sangon有限公司.1
6、.2引物设计根据GenBank已发表的PCV2全基因序列AF027217,选择ORF1和ORF2设计3对引物pl/P2,P3/P4和P5/P6(表1).引物由上海生物工程公司合成.1.3病毒培养猪圆环病毒株及病毒接种无PCV1污染的50%长满的PK15细胞系单层细胞(用DMEM培养基培养,含10%小牛血清,100U青霉素,100g?mL收稿日期:2009.03.21基金项目:河南省杰出人才创新基金项目(0621002100)作者简介:王东方(1980一),男,河南新郑人,硕士,从事动物技术研究工作.注:
7、崔保安系通讯作者,E—mail:baoancui@henau.edu.cn.王东方,等:猪圆环病毒PcR检测方法的建立田链霉素),37oC培养18h,当细胞增至80%时弃去培养液,用Hank's碱性盐溶液配制的300mmol?L葡萄糖胺37℃作用30min.换新鲜培养液,至细胞长满.细胞未出现任何特异性病变,仍保持良好状态,培养72h,用0.25%胰蛋白酶.EDTA消化,盲传3代后,取培养液一20℃室温冻融3次.一70℃保存.1.4PCV模板DN的制备参照分子克隆实验指南所述DNA提取方法进行.1.5猪
8、圆环病毒PCR扩增PCV2PCR反应采用50反应体系,其组份如下:10×PCR缓冲液5tLL,MgC12浓度为4mmol?L～,NTPs浓度为200tLmol?L～,Taq酶1U,引物P1,P2浓度为0.5p.mol?L～,模板5,最后用双蒸馏水补至50p.L.PCR扩增条件为:95oC预变性5min,按95℃1min,55cI=30s,72oC1min,共进行30个循环,然后72℃延伸10min,结束后用0.8%琼脂糖凝胶(含0.5ttg
