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1、黄连素对人宫颈癌Hela细胞株的体外作用研究论文.freelechanismsofberberineinhumancervicalcancerHelacelllineinvitro.MethodsCellgroinedinecellapoptosrate.TheexpressionofCOX-2andBcl-2proteinsmunocytochemistrymethod.ResultsBerberineinducedcytotoxicityandapoptosisinhumancervicalcarcinomaHelacell
2、sintime-dependentanddose-dependentmanner.Berberinecoulddoaandinduceapoptosisinvitro.Doaybeinvolvedinberberine-inducedapoptosisofHeLacells.Keya公司产品；小牛血清为杭州四季青生物制品公司生产；鼠抗人COX-2、Bcl-2单克隆抗体为福州迈新生物制品公司产品；全自动酶标仪为惠普公司生产。1.4细胞培养将Hela细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中(内含谷氨酰胺及100万U/L
3、青、链霉素),置37℃、5%CO2饱和湿度下培养,每2～3d传代1次,取对数生长期细胞用于实验。1.5四氮唑蓝比色法检测细胞毒作用取对数生长期Hela细胞(5×105/mL),24h待大部分贴壁后分别加入不同浓度的黄连素溶液(0.625、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80、160μmol/L)20μL,继续培养24、48、72ｈ,细胞对照组每孔加入20μL培养液；空白对照组在铺孔时不加细胞悬液,只加200μL培养液。每个浓度各设3个平行孔,置37℃、5%CO2培养箱中分别培养后,加入5mg/mLMTT20μL,继续
4、温育4h后吸弃上清,加入DMSO150μL,振荡10min后,用自动酶标读数仪在波长570nm处测定各孔A值。实验重复3次,取3次平均值作为实验结果。按下列公式计算肿瘤细胞增殖抑制率。肿瘤细胞增殖抑制率(%)＝(对照组吸光度A均值－实验组吸光度A均值/对照组吸光度A均值)×100%1.6原位末端标记法测细胞凋亡率接种细胞数为1×108/mL,把Hela细胞分别接种于24孔板中,同时在每个孔中放置载玻片后于37℃、5%C02下培养,爬片24h,分别按分组加药,加药后在24h捞片。分空白对照组、黄连素作用组(1.25、5.0、20、
5、80μmol/L),每孔设4个复孔。自然干燥后用40g/L多聚甲醛固定,进行原位末端标记(TUNEL)染色,TUNEL染色步骤按试剂盒说明书进行。光镜下观察凋亡细胞呈棕黄色,阴性细胞呈蓝色。光镜下计算凋亡指数(AI)：数5个高倍数1000个细胞,分别计算调亡细胞数和总细胞数。AI(%)＝凋亡细胞数/总细胞数×100%1.7免疫组化法检测Hela细胞COX-2、Bcl-2蛋白表达收集细胞,调整浓度为1×106/mL,接种于已置盖玻片的24孔板内,待细胞贴壁后将原液弃去,分别加入终浓度为5.0、20、80μmol/L的黄连素培养液,
6、设不加药对照组。每个浓度设4个复孔,继续培养48h。取出有贴壁细胞的盖玻片(细胞爬片),PBS冲洗并晾干,95%乙醇固定20min。进行免疫组化染色SP,操作步骤按SP试剂盒说明书进行,用PBS代替一抗作为阴性对照,阳性对照片由福州迈新生物公司提供。结果判定：细胞浆内出现棕黄色颗粒者为COX-2阳性；细胞浆、细胞核内出现棕黄色颗粒者为Bcl-2阳性；以着色强度和阳性细胞数综合判定最终结果：无色或阳性细胞数5%为(-),染色呈浅黄色或阳性细胞数达5%～25%为(+),染色呈棕黄色或阳性细胞数达25%～50%为(++),染色呈棕色或
7、阳性细胞数达50%～75%为(+++),染色呈深棕色或阳性细胞数75%为(++++)。1.8统计学方法所有数据用x±s表示,使用SPSS11.0统计软件包。统计学采用独立样本t检验、复测量方差分析。2结果2.1黄连素对Hela细胞的生长抑制作用(见表1)表1不同浓度黄连素作用不同时间对Hela细胞的增殖抑制率比较(略)2.2COX-2和Bcl-2表达测定结果根据数据采用独立样本t检验,结果显示,对照组与各浓度药物作用组Hela细胞COX-2均呈高表达(+++),该蛋白定位于细胞浆,黄连素组与对照组细胞COX-2蛋白表达比较无统计
8、学差异(t＝1.307,P＝0.244)。对照组Hela细胞细胞浆、细胞核呈棕黄色染色,即Bcl-2蛋白表达呈(++++),阳性表达率为78.21%±1.34%；5.0、20、80μmol/L的黄连素分别作用于Hela细胞后,Bcl-2蛋白表达逐渐降低,分别为7
