志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析论文

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1、志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析论文【摘要】目的对志贺菌敏感株与诱导耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较，寻找细菌耐多药相关蛋白。方法采用4类抗生素的次抑菌浓度，对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验；对志贺菌敏感株及诱导耐多药株全菌蛋白进行双向电泳；电泳图谱采用ImageMaster2DPlatinum软件分析；差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MOLDITOF-TOF质谱）分析。结果成功获得志贺菌诱导耐多药株，在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出（946±3

2、7）个和（1096±189）个蛋白质斑点；共发现48个差异表达的蛋白点，其中5个质谱鉴定为ABC转运蛋白、谷胺酰转肽酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、翻译延长因子Tu、单链DNA结合蛋白；其中前3个蛋白中在耐多药株中表达量增强，后2个减弱。结论5个耐多药相关蛋白中在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调；ABC转运蛋白在志贺菌诱导耐多药机制中起重要作用。【关键词】志贺菌近年来，随着抗生素的广泛使用甚至滥用，造成志贺菌频繁发生变异.freelmobilinepHgradientpH3～10,L=24cm）；IP

3、G缓冲液、IPG覆盖液、两性电解质pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-胆酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美国AmershamPharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素（urea）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、蛋白酶抑制剂丙甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）(美国Sigma公司)。固相pH梯度等电聚焦仪IPGphorIEF

4、System,垂直板电泳仪、ImageScanner光密度扫描仪、图像分析系统（美国AmershamPharmacia公司）。12方法121蛋白质双向电泳（1）蛋白提取方法：采用超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改进。（2）可溶性总蛋白定量：应用BradFord法〔3〕对提取的可溶性总蛋白进行定量；（3）第一相固相pH梯度等电聚焦:按文献〔4〕,程序分别为30V7h，60V7h，150V05h，300V1h，600V1h，8000V12h。（4）平衡：按文献

5、〔3〕。（5）第二相垂直板SDS-PAGE电泳：按文献〔3〕。（6）染色：银染按AmershamBioscience的银染方案稍作改进〔4〕。考马斯亮蓝染色按Neuhoff等的方法进行〔5〕。（7）图像扫描分析：用AmershamBioscience的扫描仪投射扫描，分辨率为300dpi。数字化图像文件运用ImageMaster2DPlatinum软件分析。图像分析过程包括蛋白质斑点的检测、量化、背景扣除、匹配。蛋白质斑点经自动检测后进行手工校对，匹配之前先选一块胶作为参考凝胶，其他凝胶都与之匹配。1

6、22质谱分析（1）质谱样品制备：比较双向电泳图谱，找到差异蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于15ml的Eppendorf管中,按文献〔6〕方法处理样品。(2)质谱鉴定:样品按照1∶1的比例,与含有α-氰基-羟基苯丙烯酸的50%乙腈/01%甲酸的溶液混合。所有质谱在4700型MALDITOF-TOF蛋白质分析系统下获得。选择反射式阳离子捕获方式，质量精确度为50mg/L;MS光谱质量范围800～4000Da。123数据库检索光谱在全球蛋白服务工作站（GlobalProteinServer

7、IC)诱导耐多药结果志贺菌出发菌的抑菌浓度（MIC）分别为头孢噻吩32mg/L，诺氟沙星05mg/L，庆大霉素2mg/L，磺胺甲基异恶唑512mg/L。将此出发菌在1/2MIC的LB培养基中传代，最终得到MIC≥4倍诱导前的耐多药菌株，分别是出发菌株的6，6，8，8倍。22蛋白质双向电泳图谱比较(1)敏感株：相同实验条件及参数设置情况下,对志贺菌可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离，发现3次双向电泳图谱非常相似，蛋白质上样量为100μg，pH3～10,24cm线性干胶条通过ImageMaster2

8、DPlatinum分析软件对其进行点检测，获得(946±37)个蛋白质斑点(图1)。(2)诱导耐多药株：对志贺菌诱导耐多药株可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离，获得3块凝胶的平均蛋白质点数为1096±189（图2）。经过背景消减后，将其中1块凝胶作为参考凝胶进行匹配，匹配点数为1078±26，其匹配率为9836％。232种菌株蛋白质差异表达谱分析以诱导耐多药株双向凝胶图谱为参考凝胶，与敏感株进行匹配，匹配蛋白质点数为637±16，匹配率为6879