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1、人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步化方法的研究论文.freelL/L的DMEM培养液培养24h。根据流式细胞术结果选择的最佳同步化HKC的胎牛血清浓度。将HKC的同步化处理时间分别延长为24h、48h和72h,选择最佳同步化时间。用MTT法绘制生长曲线观察血清饥饿处理对HKC生长的影响。采用免疫细胞化学方法验证血清饥饿同步化处理HKC的效果。结果:选择无血清（0mL/L）和1mL/L为HKC最佳同步化的胎牛血清浓度,选择48h为HKC同步化最佳时间。细胞生长曲线表明采用1mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48h后恢复正常培养的HKC细胞,其生长曲线更接近于正常培养的细胞。Brdu进一步证明,
2、用1mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48h可以使90%以上的HKC细胞处于G0/G1期。结论:用1mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48h可获得90%以上的G0/G1期HKC。关键词肾小管上皮细胞;同步化;血清饥饿法;G0/G1阻滞肾小管萎缩和间质纤维化是终末期肾病发生和进行性恶化的主要危险因素之一,而肾小管萎缩和肾间质纤维化的发生与肾小管上皮细胞周期变化密切相关1。因此建立有效的能将肾小管上皮细胞同步化于G0期的方法,对研究肾小管上皮细胞增殖周期以及由此引起的再生修复或间质纤维化具有重要意义。血清饥饿法是能将细胞周期停滞于G0/G1期同时又较少影响细胞周期发育进程的一种简便有效的同
3、步化方法2,3。目前尚无关于肾小管上皮细胞成熟有效的血清饥饿同步化方法的报道。本研究旨在寻找对人肾小管上皮细胞实施血清饥饿同步化方法的最佳条件,从而为研究HKC增殖周期及肾间质纤维机制提供实验基础。1材料和方法1.1材料人类肾小管上皮细胞（HKC）为本实验室保存细胞系,DMEM培养液为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。胰酶为Sigma公司产品。碘化丙啶(PI)及胰核糖核酸酶（RNaseA）为鼎国公司产品。四唑盐（MTT）及5溴脱氧尿核苷（Brdu）为Sigma公司产品。Brdu抗体为Chemicon公司产品。SP试剂盒为北京中杉公司产品。流式细胞仪为BD公司产品。1.2方法
4、1.2.1细胞培养HKC使用的培养基为含100mL/L胎牛血清及青霉素（50U/mL）、链霉素（50U/mL）的DMEM培养液,培养条件为37℃、50mL/LCO2及饱和湿度的恒温细胞培养箱中培养4。（1）不同胎牛血清浓度HKC的培养:将HKC分为7组,培养至对数生长期,弃去培养液,PBS洗涤3次,分别加入0、1、2、3、4和5mL/L胎牛血清的DMEM培养液,对照组加入100mL/L胎牛血清的DMEM培养液,培养24h收获细胞,每组重复培养3次5。（2）不同时间HKC的培养:将HKC分为6组,培养至对数生长期,弃去培养液,PBS洗涤3次,分别加入0、1mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养
5、24h、48h和72h收获细胞,每组重复培养3次5。1.2.2细胞周期检测用含0.2mL/LEDTA、2.5g/L胰蛋白酶消化上述各组培养细胞,收集于10mL的离心管中,用2.5mLPBS洗涤2次,1000r/min离心5min,弃上清,加入0.3mLPBS将细胞混匀,再加入0.6mL无水乙醇即振荡混匀,置4℃冷藏备用。细胞固定24h后用于检测。细胞样本用PBS洗涤2次,除去无水乙醇,加少量PBS将细胞吹散(每份要求细胞数为5～10×105),加入PI（终浓度为50mg/L）和胰核糖核酸酶（RNaseA）（终浓度为20mg/L）,用流式细胞仪检测G0/G1、S、G2/M各期的细胞数6。1.
6、2.3MTT法细胞生长曲线分析取上述各组培养细胞分别加入100mL/L胎牛血清的DMEM培养液,按每孔500个接种到96孔板,分7组,每组设3个复孔。在第1～7天,每天在同一时间点各取出3孔测试。选择490nm波长,在MicroELISA仪上读取数（A）值,绘制细胞生长曲线6。1.2.4免疫细胞化学检测将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中,将HKC以2×107/L的细胞数量接种于培养皿中进行细胞爬片,用1mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48h。于收取细胞爬片前1h将培养液中加入Brdu（终浓度为10μmol/L）。收取细胞爬片,弃去培养液,PBS清洗3次,冰丙酮固定15min。
7、PBS清洗后,1mL/LTritonX100孵育10min。按SP试剂盒说明,分别30mL/LH2O2孵育15min,封闭血清（A液）孵育15min。在4℃条件下加Brdu抗体孵育过夜。清洗后,37℃条件下再加二抗（B液）孵育15min,辣根过氧化物酶（C液）在37℃条件下孵育15min。DAB显色,苏木精复染,树胶封片。显微镜下观察计数10个无重复高倍视野（×400）的细胞阳性率,取平均值。1.2.5统计学处理计量资料
