兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定论文

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1、兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定论文叶发刚夏长所张卫兵夏仁云【关键词】骨髓间充质干细胞;兔;离心法,.freelL，采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化，观察细胞形态、超微结构和表面标志物的表达，从而对其进行鉴定。观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。结果经密度梯度离心、贴壁筛选并结合传代所得到的间充质干细胞很纯，第3代和第5代细胞形态单一，细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1、3、5代细胞增殖能力强.freelarroesenchymalstemcells（BM-MSCs）ofrabbits.MethodsBM-MSCsthebonemarroL）o

2、ftheneicroscopyorphologicfeaturesandimmunocytochemis-trytoexaminetheexpressionofcellsurfaceantigens.Thegroorerapidlythanthoseof8thand10thgeneration.TheseculturedcellsshomunoreactivitytoCD44andCD90butnotCD34andloicroscopy.ConclusionPurifiedBM-MSCscanbeobtainedviathisprotocol.Cellsof1st，3rd，5thgenerat

3、ionent.［KEYSC）是一种具有多向分化潜能的干细胞，特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等细胞分化［1］。但骨髓中MSC的数量有限，含量极低，MSC所占的比例非常小，通常105～106个骨髓有核细胞中仅有1个MSC［2］。体外如何获取、纯化MSC并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提。本实验联合应用密度梯度离心和贴壁筛选的方法从骨髓中分离MSC并对其纯化，观察其在整个生命周期的形态、传代、增殖状态、细胞的超微结构及细胞表面抗原的表达，探讨体外分离培养MSC的生长规律，为大规模地获得生物学性状良好的骨髓MSC，进一步研究骨髓MSC的诱导分化和应用奠定基础。1材

4、料与方法1.1实验动物新西兰纯种大耳白兔1只（2月龄），雌性，体质量3.0～4.0kg，由同济医学院实验动物中心提供，同济医学院附属协和医院实验动物中心饲养。1.2实验方法1.2.1MSC取材与原代培养将大白兔用3g/L戊巴比妥钠（1.0mL/kg）耳缘静脉麻醉后，侧卧手术台上，于髂后上嵴处剪毛备皮，体积分数0.01活力碘消毒，铺无菌洞巾，2g/L利多卡因手术部位局部麻醉。16号骨髓穿刺针接10mL注射器，穿刺进入骨髓腔，注射器内含稀释（3000kU/L）的肝素钠1.0mL，抽取骨髓液约5.0mL。细胞分离培养及传代按文献［3］方法进行。1.2.2MSC的生长曲线描绘分别取第1、3、5、8、1

5、0代MSC，用2.5g/L胰蛋白酶消化后加入L-DMEM完全培养液，调整细胞密度至1.0×107/L，接种于5个24孔培养板中，培养板上作相应标记，每孔细胞悬液1.0mL。每天每板取3孔消化，形成细胞悬液，混匀，行细胞计数并计算均值，连续9d（消化8次）。然后以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。1.3MSC的鉴定1.3.1形态学观察在倒置显微镜下不定期观察细胞生长情况。1.3.2超微结构观察取生长状况良好的细胞2瓶，用2.5g/L胰酶将细胞消化下来，800r/min离心5min，弃上清，加入约1.5mL的L-DMEM完全培养液重悬细胞，移至1.5mL的Ep管中，1500r/min离心

6、10min，弃上清，可见Ep管底下方有一粒约芝麻大小灰白色团块，沿管壁小心加入25g/L戊二醛约1.5mL固定2h，再用锇酸溶液固定2h，乙醇梯度及丙酮脱水，环氧树脂包埋，做成超薄切片，醋酸钠及枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察其超微结构。1.3.3细胞表面标志鉴定收集第3代生长状况良好的细胞，传代培养于6孔板中行爬片，采用免疫化学ABC法检测CD34、CD44、CD90等抗原表达。2结果2.1细胞分离经1.073kg/L的Percoll分离液分离后，可以看到管内液体分为明显的4层。最上层约占液柱的1/2，为红色的培养液层;第3层约占液柱的1/2，为乳白色的Percoll分离液层;在两层的交界处

7、为高约1.0mm的灰白色云雾状层，为单个核细胞层（此层为所要的细胞层）;最底层紧附试管壁，为一薄层红色的细胞层，为密度较大的红细胞等。2.2MSC的原代培养原代培养12h后大部分细胞贴壁;2～3d后细胞形态呈较一致的多边形、梭形;3～5d后可见明显的集落形成，增殖速度快，集落之间互相靠近。10～12d左右细胞互相融合，达90%左右，此时细胞排列呈比较均一的螺旋状或漩涡状。2.3MSC的传代增殖传代