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时间:2018-07-06
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1、微缺氧对三氧化二砷抑制胃癌细胞SGC7901生长的影响【关键词】微缺氧;三氧化二砷;人胃癌细胞SGC7901;凋亡InhibitoyEffectofArsenicTrioxideonGastricCancerCellSGC7901DuringHypoxiaKeyol/L;四甲基偶氮唑蓝(MTT)(购于上海华舜生物工程有限公司)。1.2方法1.2.1微缺氧条件的制造运用产气袋法(GasPaK)制造微缺氧条件。通过血气分析仪监测含小牛血清的RPMI1640培养液中PO2、PCO2和pH的变化,本装置在48h内PO2、
2、PCO2和pH稳定,并能达到微缺氧细胞培养的条件(1%~5%氧、5%二氧化碳及90%氮)[4]。1.2.2MTT法检测As2O3对不同氧状态下SGC7901细胞的抑制作用将对数生长期的人胃癌细胞SGC7901制成5×104个/mL的细胞悬液,每孔200μL加入两块96孔培养板内。实验设药物试验组及肿瘤细胞阴性对照组,将三氧化二砷的5个不同浓度分别加在96孔板内,每孔加药量20μL,每个剂量3个平行孔,重复7次。两块96孔培养板分为微缺氧组及常氧组。常氧组在CO2箱内培养(20%氧、5%二氧化碳及75%氮)48h,微
3、缺氧组先入缺氧密封盒并放入37℃隔水式电热恒温烤箱孵育16h,取出后在CO2箱内继续培养32h。两者同时取出离心后吸弃上清,每孔加无血清1640200μL,MTT20μL,CO2箱孵育4h弃上清。每孔加二甲亚砜(DMSO)200μL,用自动酶标读数仪(BioRad550型,美国,波长570nm)测定每孔A值。药物作用效应即抑制率(fa)=(1实验组A值/对照组A值)×100%。根据中效方程式fa/fu=(D/Dm)m(fu为1fa,D为药物浓度,m为斜率,Dm为中效浓度,即0.5效应时的药物浓度),计算Dm值。
4、1.2.3流式细胞仪分析用As2O3常氧下中效浓度的1/3浓度(5.6μmol/L)为处理浓度,取对数生长期的人胃癌细胞SGC7901制成5×104个/mL的细胞悬液,分为对照组、As2O3组、缺氧对照组、缺氧As2O3组各20mL细胞悬液入100mL培养瓶,As2O3组和缺氧As2O3组分别加入5.6μmol/L的As2O32mL处理SGC7901细胞,缺氧对照组、缺氧As2O3组先入缺氧密封盒并放入恒温水浴箱孵育16h,取出在CO2箱内培养56h。对照组、As2O3组在CO2箱内培养。72h后0.1%胰蛋白酶消
5、化收集细胞,PBS洗涤,70%乙醇固定1h,PBS洗涤2次,将等体积的细胞悬液和PI染液混合,4℃放置30min,将样品放入FCM的样品室,以激发波长488nm测定细胞周期,并用ModfitLT2.0软件分析。并重复5次。1.3统计学处理数据用±s表示,分析采用配对t检验或方差分析;数据均用统计软件包SAS8.0分析。2结果2.1常氧和微缺氧状态下As2O3对人胃癌细胞株SGC7901生长抑制作用的变化不同浓度的As2O3在常氧状态下对SGC7901生长均有抑制作用,呈剂量效应关系[γ=0.973,Dm=(19.
6、32±0.52)μmol/L]。在微缺氧状态下,低浓度的As2O3(2μmol/L)对SGC7901生长没有抑制作用,增高浓度后具有抑制作用,并呈剂量效应关系[γ=0.959,Dm=(34.56±0.31)μmol/L]。但同常氧状态下As2O3对人胃癌细胞株SGC7901的抑制率比较,微缺氧状态下,各浓度的As2O3对人胃癌细胞株SGC7901生长的抑制作用均有减弱,抑制率明显下降(P<0.01),见表1。2.2流式细胞仪检测结果在不同氧状态下相同浓度的As2O3作用SGC7901细胞72h后,SGC
7、7901细胞产生明显的亚表1不同氧状态下As2O3对人胃癌细胞株注:P<0.01两组间相同各浓度抑制率比较;★、▲P<0.01同各自细胞对照比较;◆P>0.05两组间细胞对照比较G1期峰,同未经处理的细胞对照组比较G2/M及S期细胞百分比上升,G0/G1细胞百分比下降,说明细胞滞留于G2/M及S期。常氧下凋亡细胞占9.62%,而微缺氧组凋亡细胞占3.73%,即微缺氧组As2O3作用所诱导的凋亡率明显下降。未经As2O3处理的常氧及微缺氧细胞对照组间流式细胞仪分析结果无差异,见表2。表2不同氧状态下A
8、s2O3对SGC7901细胞周期 3讨论近年来,多项研究发现低浓度As2O3能通过诱导肿瘤细胞凋亡,达到抑制肿瘤细胞生长的作用。有学者认为As2O3可能通过干扰巯基酶类的活性[5],调控癌相关基因表达[6]以及通过阻抑癌细胞周期进程[7]等途径来抑制癌细胞增殖,诱导癌细胞分化及凋亡。本实验资料显示,As2O3在不同氧状态下均能
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