航天诱变凤仙花种子抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究初报论文

《航天诱变凤仙花种子抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究初报论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、航天诱变凤仙花种子抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究初报论文廖敏，于秀霞，阮期平，杨慧，汤泽生，罗英【关键词】航天诱变;凤仙花;抗菌肽;分离纯化抗菌肽(AntimicrobialPeptides，AMPs)，是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽.freell·min-1的流速进行洗脱，紫外检测仪器检测其OD210处的吸光值。收集具有抑菌活性的样品冷冻真空干燥至粉末，－20℃保存。同时参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的Tricine-SDS-PAGE电泳系统检测每步产品的分子量并进行抑菌试验。2.3抗菌肽的纯化用0.2μm的一次性滤头对超滤分离出来的分子量小于5KD的小分

2、子蛋白质样品进行过滤，除去不溶性杂质。再采用安捷伦C18制备柱进行抗菌肽的纯化，流动相99.9%乙腈与0.1%三氟乙酸TFA，流速3.0ml·min-1，柱温23℃。用紫外检测器在波长为210nm下测紫外吸收值。收集各峰，冷冻真空干燥至粉末。将冻干品稀释后做抑菌试验，有抑菌活性的峰就含有抗菌肽。2.4抗菌肽抑菌活性的测定采用纸片法来进行抑菌活性检测。细菌培养基为LB固体培养基。菌种为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。在直径为10cm的平皿内倾倒培养基；待平板冷却，吸取调整好浓度的，处于对数生长期的供试菌悬液100μl于平板上，用无菌涂布器均匀涂布于平板

3、表面。每种供试菌涂布两个平板，每个平板贴4张直径为6mm的无菌纸片，其中两片加滴加20μl抗菌肽样品，另外两片滴加无菌水作对照。在37℃培养24h(绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为24℃)，测量各抑菌圈直径，以表示抗菌活性。2.5抗菌肽的电泳检测以分子量73，50，35，25，16，8，2kDa蛋白质为标准蛋白。因此本课题组参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的Tricine-SDS-PAGE电泳系统，对提取的小分子多肽的分子量进行检测。3结果3.1蛋白质粗提结果由图1可以看出，蛋白质粗提物中含有多种蛋白质，其中在29KD附近存在有染色较深的条带，说明粗提物中含有小分

4、子蛋白质，且含量较高。图1中条带2～5是第1次超滤，用50KD的膜包截留得到的分子量小于50KD的蛋白质。3.2抗菌肽超滤初步纯化结果经过超滤对种子总蛋白质进行初步分离，得到的分子量小于5KD的小分子蛋白质样品进行电泳检测，分别用考马斯亮蓝和硝酸银染色法对凝胶进行染色，在2KD左右都可以清楚的看到一条清晰的小分子蛋白质条带，在图上还出现了8KD以上的蛋白质条带，这是由于5KD超滤膜在截留的过程中，在压力的作用下，5KD的膜包可以通过3倍分子量以上的蛋白质。3.3抗菌肽纯化结果对超滤得到的小分子蛋白质采用高效液相再进行分离纯化。①首先采用C18制备柱来分离分子量小于5K

5、D的蛋白质，根据峰的情况，分段搜集分离出来的物质，冻干，溶于无菌蒸馏水中。经过Tricine-SDS-PAGE电泳和抑菌活性鉴定后发现，搜集的a-b段在2KD左右有条带，也具有抑菌活性。由于超滤分离出来的小分子蛋白质杂质太多，需要进一步纯化a-b段物质。②按照高效液相第1次制备的方法对搜集的a-b段进行再纯化，结果见图2，可知第2次分离制备的蛋白质相对较纯，杂质含量少。搜集主峰，然后进行电泳及抑菌活性检测，检测发现主峰分子量在2KD左右，且具有抑菌活性。3.4电泳检测结果对高效液相制备过程中，各步骤产品冻干粉溶解，进行电泳鉴定其分子量。结果见图2。电泳检测说明此从航天

6、诱变凤仙花种子中提取的物质分子量在2KD左右，带型清晰，紧凑，结果非常理想。3.5抑菌活性检测结果与分析抑菌实验结果见表1。结果表明，从航天诱变凤仙花种子中提取出的低分子量蛋白质对金黄色葡萄杆菌、绿脓杆菌有明显的抑菌作用，且抑菌作用持续时间较长；分别观察48h和72h后，抑菌圈没有被感染。对大肠杆菌抑菌效果不太明显，抑菌圈较小，对枯草芽孢杆菌几乎没有抑菌作用。表1抗菌肽抑菌实验结果（略）4讨论本实验选用动物源性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)和植物源性枯草芽孢杆

7、菌(Bacillussubtilis)4种菌株来做抑菌试验，发现提取的低分子量蛋白质对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌有明显的抑菌作用，但对大肠杆菌的抑菌作用比较弱，对枯草芽孢杆菌的抑菌作用不明显。在接种的过程中发现，随着低分子量蛋白质溶液量的增加，抑菌圈从无到有，从小到大，因而证明种子中确实存在具有抗菌作用的分子量大约2KD左右的小肽，即抗菌肽。但是其抗菌机制和抗菌谱还需要进一步研究建立。通过对航天诱变凤仙花种子总蛋白质的粗提、分离和纯化，经电泳获得了分子量在2KD左右的具有抗菌活性的小分子蛋白质，推测航天诱变的凤仙花种子中存在抗菌肽。1997年，Tail