航天诱变凤仙花种子抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究初报的论文

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1、航天诱变凤仙花种子抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究初报的论文作者：廖敏，于秀霞，阮期平，杨慧，汤泽生，罗英【关键词】航天诱变;凤仙花;抗菌肽;分离纯化抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)，是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，具有抗细菌或真菌作用，有些还具有抗原虫、病毒或肿瘤细胞的功能［1］。抗菌肽具有广谱的抗菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌具有抑制作用；可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又不破坏动物体内的正常细胞［2，3］。因此，抗菌活性肽的开发与应用研究已成为国内外昆虫学、植物学、生理学、药理学研究的热点。　　凤仙花是一种较早开发的药

2、用植物。中医认为,凤仙花子能通经活血、软坚散结；根叶有散血通络、祛风止痛、解毒疗疮之功效。近年来，研究发现凤仙花还有抑菌、消炎和抗癌等作用。本试验采用的材料是普通凤仙花种子搭载“神舟四号”航天飞船绕太空运行6天18小时后播种，由凤仙花航天突变植株获得的第四代种子(sp4)。研究［4～7］证实航天诱变凤仙花种子，由于宇宙射线、交变磁场、微重力和高真空等因素的影响，其染色体出现了大规模不规则变异，可能导致基因突变，从而影响植物体内蛋白质的合成。因此，航天诱变凤仙花抗菌肽的分离、纯化具有重要的研究价值，对航天诱变育种、抗菌肽的大量生产以及抗菌药物的开发等具有实际意义，在国内

3、外尚属首次。.cOm　　1材料　　航天诱变凤仙花种子(sp4)由西华师范大学生命科学学院汤泽生教授提供。　　供试菌株：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和大肠杆菌(escherichiacoli)由实验室保存；金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)购自于中国科学院微生物研究所菌种保存中心，绿脓杆菌(p.aeruginosa)由四川省绵阳市第三人民医院呼吸科提供。　　2方法　　2.1粗提物的收集及抑菌作用称取适量航天诱变凤仙花干种子，磨成粉末，采用磷酸缓冲液于4℃冰箱浸提24h后离心取上清液。沉淀反复浸提数次，合并上清液，于4℃采用硫酸

4、铵（80%饱和度）盐析收集沉淀的蛋白质，并透析脱盐，获得种子总蛋白质。　　将种子总蛋白溶液用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌做抑菌实验。　　2.2抗菌肽的初步纯化采用millipore小型切向流超滤系统对脱盐后的蛋白质进行初步分离，选用使用截留量为50kd，10kd和5kd的膜包经过3次分级分离，获得了抗菌肽粗提物。　　将上述各提取物上样c18柱，以99.9%乙腈和0.1%三氟乙酸tfa为洗脱液，以3.0ml·min-1的流速进行洗脱，紫外检测仪器检测其od210处的吸光值。收集具有抑菌活性的样品冷冻真空干燥至粉末，－20℃保存。　　同时参考孙雪文等［

5、8］的方法，采用改进的tricine-sds-page电泳系统检测每步产品的分子量并进行抑菌试验。　　2.3抗菌肽的纯化用0.2μm的一次性滤头对超滤分离出来的分子量小于5kd的小分子蛋白质样品进行过滤，除去不溶性杂质。再采用安捷伦c18制备柱进行抗菌肽的纯化，流动相99.9%乙腈与0.1%三氟乙酸tfa，流速3.0ml·min-1，柱温23℃。用紫外检测器在波长为210nm下测紫外吸收值。收集各峰，冷冻真空干燥至粉末。将冻干品稀释后做抑菌试验，有抑菌活性的峰就含有抗菌肽。　　2.4抗菌肽抑菌活性的测定采用纸片法来进行抑菌活性检测。细菌培养基为lb固体培养基。菌种为枯

6、草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。在直径为10cm的平皿内倾倒培养基；待平板冷却，吸取调整好浓度的，处于对数生长期的供试菌悬液100μl于平板上，用无菌涂布器均匀涂布于平板表面。每种供试菌涂布两个平板，每个平板贴4张直径为6mm的无菌纸片，其中两片加滴加20μl抗菌肽样品，另外两片滴加无菌水作对照。在37℃培养24h(绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为24℃)，测量各抑菌圈直径，以表示抗菌活性。　　2.5抗菌肽的电泳检测以分子量73，50，35，25，16，8，2kda蛋白质为标准蛋白。因此本课题组参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的tricine-sd

7、s-page电泳系统，对提取的小分子多肽的分子量进行检测。　　3结果　　3.1蛋白质粗提结果由图1可以看出，蛋白质粗提物中含有多种蛋白质，其中在29kd附近存在有染色较深的条带，说明粗提物中含有小分子蛋白质，且含量较高。图1中条带2～5是第1次超滤，用50kd的膜包截留得到的分子量小于50kd的蛋白质。　　3.2抗菌肽超滤初步纯化结果经过超滤对种子总蛋白质进行初步分离，得到的分子量小于5kd的小分子蛋白质样品进行电泳检测，分别用考马斯亮蓝和硝酸银染色法对凝胶进行染色，在2kd左右都可以清楚的看到一条清晰的小分子蛋白质条带，在图上还出现了8kd以上的蛋