航天诱变凤仙花种子抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究初报

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1、航天诱变凤仙花种子抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究初报作者：廖敏，于秀霞，阮期平，杨慧，汤泽生，罗英【关键词】航天诱变;凤仙花;抗菌肽;分离纯化抗菌肽(AntimicrobialPeptides，AMPs)，是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，具有抗细菌或真菌作用，有些还具有抗原虫、病毒或肿瘤细胞的功能［1］。抗菌肽具有广谱的抗菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌具有抑制作用；可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又不破坏动物体内的正常细胞［2，3］。因此，抗菌活性肽的开发与应用研究已成为国内外昆虫学、植物学、生理学、药理学研究的热点。　　凤仙花是一种较早开发的药用植物。中医认为,凤仙花子

2、能通经活血、软坚散结；根叶有散血通络、祛风止痛、解毒疗疮之功效。近年来，研究发现凤仙花还有抑菌、消炎和抗癌等作用。本试验采用的材料是普通凤仙花种子搭载“神舟四号”航天飞船绕太空运行6天18小时后播种，由凤仙花航天突变植株获得的第四代种子(SP4)。研究［4～7］证实航天诱变凤仙花种子，由于宇宙射线、交变磁场、微重力和高真空等因素的影响，其染色体出现了大规模不规则变异，可能导致基因突变，从而影响植物体内蛋白质的合成。因此，航天诱变凤仙花抗菌肽的分离、纯化具有重要的研究价值，对航天诱变育种、抗菌肽的大量生产以及抗菌药物的开发等具有实际意义，在国内外尚属首次。　　1材料　　航天诱变凤仙花种子(

3、SP4)由西华师范大学生命科学学院汤泽生教授提供。　　供试菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和大肠杆菌(Escherichiacoli)由实验室保存；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)购自于中国科学院微生物研究所菌种保存中心，绿脓杆菌(P.aeruginosa)由四川省绵阳市第三人民医院呼吸科提供。　　2方法　　2.1粗提物的收集及抑菌作用称取适量航天诱变凤仙花干种子，磨成粉末，采用磷酸缓冲液于4℃冰箱浸提24h后离心取上清液。沉淀反复浸提数次，合并上清液，于4℃采用硫酸铵（80%饱和度）盐析收集沉淀的蛋白质，并透析脱盐，获得种子总蛋白质。　　

4、将种子总蛋白溶液用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌做抑菌实验。　　2.2抗菌肽的初步纯化采用Millipore小型切向流超滤系统对脱盐后的蛋白质进行初步分离，选用使用截留量为50KD，10KD和5KD的膜包经过3次分级分离，获得了抗菌肽粗提物。　　将上述各提取物上样C18柱，以99.9%乙腈和0.1%三氟乙酸TFA为洗脱液，以3.0ml·min-1的流速进行洗脱，紫外检测仪器检测其OD210处的吸光值。收集具有抑菌活性的样品冷冻真空干燥至粉末，－20℃保存。　　同时参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的Tricine-SDS-PAGE电泳系统检测每步产品的分子量并进行抑菌试

5、验。　　2.3抗菌肽的纯化用0.2μm的一次性滤头对超滤分离出来的分子量小于5KD的小分子蛋白质样品进行过滤，除去不溶性杂质。再采用安捷伦C18制备柱进行抗菌肽的纯化，流动相99.9%乙腈与0.1%三氟乙酸TFA，流速3.0ml·min-1，柱温23℃。用紫外检测器在波长为210nm下测紫外吸收值。收集各峰，冷冻真空干燥至粉末。将冻干品稀释后做抑菌试验，有抑菌活性的峰就含有抗菌肽。　　2.4抗菌肽抑菌活性的测定采用纸片法来进行抑菌活性检测。细菌培养基为LB固体培养基。菌种为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。在直径为10cm的平皿内倾倒培养基；待平板冷却，吸取调整好浓度的，

6、处于对数生长期的供试菌悬液100μl于平板上，用无菌涂布器均匀涂布于平板表面。每种供试菌涂布两个平板，每个平板贴4张直径为6mm的无菌纸片，其中两片加滴加20μl抗菌肽样品，另外两片滴加无菌水作对照。在37℃培养24h(绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为24℃)，测量各抑菌圈直径，以表示抗菌活性。　　2.5抗菌肽的电泳检测以分子量73，50，35，25，16，8，2kDa蛋白质为标准蛋白。因此本课题组参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的Tricine-SDS-PAGE电泳系统，对提取的小分子多肽的分子量进行检测。　　3结果　　3.1蛋白质粗提结果由图1可以看出，蛋白质粗提物中含有多种蛋白

7、质，其中在29KD附近存在有染色较深的条带，说明粗提物中含有小分子蛋白质，且含量较高。图1中条带2～5是第1次超滤，用50KD的膜包截留得到的分子量小于50KD的蛋白质。　　3.2抗菌肽超滤初步纯化结果经过超滤对种子总蛋白质进行初步分离，得到的分子量小于5KD的小分子蛋白质样品进行电泳检测，分别用考马斯亮蓝和硝酸银染色法对凝胶进行染色，在2KD左右都可以清楚的看到一条清晰的小分子蛋白质条带，在图上还出现了8KD以上的蛋白质条带，这是