sirnaid1对人肝癌细胞hepg2中erk信号通路的影响的论文

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1、siRNAID1对人肝癌细胞HepG2中ERK信号通路的影响的论文【摘要】目的观察sirnaid1转染人肝癌细胞hepg2细胞后对肝癌细胞系hepg2细胞增殖的影响及其对erk1/2通路的作用。方法实验分为4组，即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染sirnaid1组。阳离子脂质体法介导siid1转染肝癌细胞后，唑蓝比色法(mtt)观察hepg2细胞增殖情况。分别用反转录聚合酶链式反应法(rtpcr)和蛋白免疫印迹法(rna与蛋白表达的情况。结果转染sirnaid1的hepg2细胞增殖速度明

2、显减慢(p<0.01)。转染后erk1/2及perk1/2mrna表达降低(p<0.01);perk1/2蛋白的表达较空白对照组明显降低(p<0.05)，erk1/2蛋白表达空白变化不明显。结论sirnaid1转染hepg2细胞后可明显抑制细胞的增殖，使得erk1/2基因表达活性下降，提示id1有可能通过erk1/2信号转导通路介导,促进肝细胞癌hepg2细胞的增殖。【关键词】抑制因子，免疫;丝裂原激活蛋白激酶类;细胞外信号调节map激酶类;肝肿瘤;转染;信号传导;氮蓝四唑;rna，小分子

3、干扰近期发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,mapk)信号途径的激活可能是dna结合抑制因子1(inhibitorofdifferentiation/dnabinding1,idl)诱导细胞增殖的一个机制[1]。.cOm与正常组织相比较，肝癌组织中的mapk通路上的细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinase,erk)都是处于高表达及高活性状态。若使用其erk抑制剂就可以减缓细胞的增殖及引起细胞的凋亡[2]。本研究通

4、过小分子干扰rna技术使id1基因沉默，观察其对hepg2细胞增殖的影响及其对erk1/2mrna及蛋白表达的影响，探讨erk1/2及其信号转导途径与肝癌发生发展的关系。　　1材料和方法　　1.1材料人肝癌细胞株hepg2细胞(上海科学院细胞中心);sirna试剂(广州锐博生物有限公司);四甲基偶氮唑蓝(mtt，厦门泰京生物有限公司);逆转录聚合酶链反应(rtpcr)试剂盒(美国fermentas公司);pcr引物由上海鼎安生物科技有限公司合成;兔抗人erk1/2多克隆抗体，兔抗人perk1/2多克隆抗体，

5、辣根过氧化酶(hrp)标记的羊抗兔igg(美国santacruz公司)。　　1.2分组分为4组，即空白对照组(正常培养hepg2细胞组);转染试剂组(即仅加入lipofectamine2000组;转染对照组(即转染非特异性序列controlsirna组);转染sirnaid1组。　　1.3方法　　1.3.1sirna的设计和合成sirnaid1由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。　　靶序列：5’tgagcaaggtggagattct3’　　正义链：5’ugagcaagguggagauucudtdt3

6、’　　反义链：3’dtdtacucguuccaccucuaaga5’　　1.3.2细胞的培养与转染细胞常规培养于含10%胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基，于37℃、体积分数为0.05的co2培养箱中培养。取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基(无抗生素)将消化后的hepg2细胞制备成细胞悬液;调整细胞浓度为1×107l-1，接种于细胞培养板内(6孔加入2ml，每孔2×104细胞)，培养24h。参照说明书建议，将sirna浓度稀释为50nmmol/l，阳离子脂质体法介导sirnai

7、d1转染肝癌细胞。存放24h后备检测。　　1.3.3mtt法测定细胞增殖将对数生长期细胞接种于96孔板，每组设4个复孔，分别于培养24，48，72，96h后;每孔加入20μlmtt(5g/l)，继续培养4h。弃去上清，每孔加二甲基亚砜(dmso)150μl，平板摇床震摇10min，酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度(od值)。　　细胞增殖抑制率=(空白对照组od值-实验组od值)/空白对照组od值　　1.3.4rtpcr检测erk1/2及perk1/2mrna的表达水平用trizol提取总rna，反转录成c

8、dna。(1)内对照β肌动蛋白(βactin)，扩增片段556bp;循环条件：4℃预变性5min，扩增94℃30s→57℃30s→72℃45s，30个循环，最终延伸72℃7min。　　上游：5’aaagacctgtacgccaacacag3’　　下游：5’ttttaggatggcaagggacttc3’　　(2)erk1/2扩增片段