当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后p57kip2蛋白表达的影响

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1、【摘要】　　目的：观察当归对缺血再灌注损伤心肌细胞内P57kip2蛋白表达的影响，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(n=5)；假手术组(n=10)；缺血再灌注组(n=10)；当归治疗组(n=10),建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内P57kip2蛋白表达的变化。利用HPIAS2000图像分析系统测定P57kip2蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细

2、胞内P57kip2蛋白表达强，当归治疗组心肌细胞内P57kip2蛋白表达强，假手术组心肌细胞内P57kip2蛋白表达较强，缺血再灌注损伤组P57kip2蛋白表达弱。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间P57kip2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>005)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞的增殖起着重要的作用。【关键词】当归注射液；缺血再灌

3、注；心肌；P57kip2蛋白　　心肌缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,IRI)在急性心肌梗死再灌注治疗的病理生理过程中起着重要的作用。近年来研究发现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡有着密切的关系。赵明中等［1］研究发现心肌缺血再灌注可减少心肌缺血细胞凋亡,同时也能加速受损心肌细胞的凋亡过程，且凋亡细胞主要位于心肌纤维收缩带区域内和心肌梗死区周围。心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡随再灌注时间的延长而显著增多。近年来凋亡机制参与心肌缺血再灌注损伤成为临床研究的热点。　　目前在研究药物治疗心

4、肌缺血方面还没有任何一种药物能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血。当归为伞形科植物当归Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性温，能补血和血,调经止痛,润燥滑肠。有文献报道［2］,当归对冠心病患者应用当归注射液治疗能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性STT的变化,是治疗冠心病的有效药物［3］。　　P57kip2是细胞周期素依赖蛋白激酶抑制因子（CKI）中新发现的重要因子［4］，它能结合CyclinCDK复合物，抑制细胞从G1期到S

5、期的转化，从而抑制细胞增殖，被认为是一种新型的肿瘤抑制基因［5］。　　本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机理，旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。　　1材料与方法　　1.1动物模型制备及分组　　选用健康雄性Wistar大鼠（SPF级）35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5mg·(100g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［呼吸频率60次·min-1,

6、潮气量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组:正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（缺血/再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml/kg，结扎左冠状动脉前降支45min,再灌注120min）；当归注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/kg,其它处理同缺血/再灌注组）。　　1.2主要试剂　　25%当归注射液(武汉大学中南医院

7、制药厂)；即用型兔抗鼠P57kip2单克隆抗体、即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司）。　　1.3方法　　1.3.1常规HE染色　　1.3.2免疫组织化学SP法检测P57kip2相关抗原主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，P57kip2采用高压抗原修复，正常羊血清处理10min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10min，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物处理

8、10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为P57kip2的阳性对照组。　　1.4免疫组织化学结果判断　　P57kip2以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对P57kip2抗原的表达进行定量分析，每张