当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后p57kip2蛋白表达的影响论文

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1、当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后P57kip2蛋白表达的影响论文冯金彩张端莲李培安【摘要】目的：观察当归对缺血再灌注损伤心肌细胞内P57kip2蛋白表达的影响，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(n=5)；假手术组(n=10)；缺血再灌注组(n=10)；当归治疗组(n=10),建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内P57kip2蛋白表达的变化。利用HPIAS2000图像分析系统测定P57kip2蛋白在以上各组中表达的平均光密度

2、和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内P57kip2蛋白表达强，当归治疗组心肌细胞内P57kip2蛋白表达强，假手术组心肌细胞内P57kip2蛋白表达较强，缺血再灌注损伤组P57kip2蛋白表达弱。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间P57kip2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P005)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞的增殖起着重要的作用。【关键词】当归注射液；缺血再灌注；心

3、肌；P57kip2蛋白心肌缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,IRI)在急性心肌梗死再灌注治疗的病理生理过程中起着重要的作用。近年来研究发现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡有着密切的关系。赵明中等［1］研究发现心肌缺血再灌注可减少心肌缺血细胞凋亡,同时也能加速受损心肌细胞的凋亡过程，且凋亡细胞主要位于心肌纤维收缩带区域内和心肌梗死区周围。心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡随再灌注时间的延长而显著增多。近年来凋亡机制参与心肌缺血再灌注损伤成为临床研究的热点。目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种药物能绝对减少心肌梗死,对抗心肌

4、缺血。当归为伞形科植物当归Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根.freelg·(100g)-1,.freelin-1,潮气量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组:正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（缺血/再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml/kg，结扎左冠状动脉前降支45min,再灌注120min）；当归注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射当归注

5、射液0.8ml/kg,其它处理同缺血/再灌注组）。1.2主要试剂25%当归注射液(武汉大学中南医院制药厂)；即用型兔抗鼠P57kip2单克隆抗体、即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司）。1.3方法1.3.1常规HE染色1.3.2免疫组织化学SP法检测P57kip2相关抗原主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，P57kip2采用高压抗原修复，正常羊血清处理10min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10mi

6、n，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为P57kip2的阳性对照组。1.4免疫组织化学结果判断P57kip2以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对P57kip2抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视

7、野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。1.5统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q检验，检验水准α为0.05。2结果2.1HE染色正常对照组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核位于细胞中央，细胞界限清晰，结构正常；假手术组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解，结构基本上正常；缺血再灌注损伤组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂；当归治疗组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，细胞结构基本正常。2.2P57

8、kip2蛋白的表达正常对照组：心肌细胞内可见棕黄色颗粒沉积，P57kip2蛋白表达强；假手术组