拟smac促凋亡多肽的合成及其生物活性的初步研究的论文

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1、拟Smac促凋亡多肽的合成及其生物活性的初步研究的论文【摘要】目的探讨拟smac多肽的合成及其对膀胱癌细胞的促凋亡生物活性。方法应用固相多肽合成技术，合成具有细胞膜穿透性sma7融合多肽，经rphplc纯化、纯度分析，用质谱仪定性鉴定；通过荧光显微镜观察细胞凋亡形态、细胞增殖抑制率测定及流式细胞仪分析，研究其对低剂量丝裂霉素c诱导的膀胱癌t24细胞的凋亡促进作用。结果可穿透性融合多肽sma7产物峰纯度达95％以上，分子量为3278.08，质谱鉴定结果与合成预期结果完全一致；50～500μg/lsma7作用12

2、～48h，肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学改变；随着sma7浓度的增加或作用时间的延长,细胞增殖抑制率出现明显增加,药物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分别为（9.62±1.07）%～（61.48±1.15）%、（24.17±1.02）%～（72.86±1.68）%、（43.24±1.15）%～（84.91±1.74）%；肿瘤细胞凋亡率也明显增加，分别为（6.12±1.16）%～（49.81±2.11）%、（13.47±1.15）%～（64.54±2.27）%、（28.91±1.08）%～（82.36±2.1

3、9）%。结论固相合成的拟smac融合多肽sma7为高纯度的目的肽，能够稳定地转入细胞内且利用率高，并有明显促进低剂量丝裂霉素c诱导的膀胱癌t24细胞凋亡的生物活性，为进一步研究膀胱肿瘤的生物治疗积累了有价值的资料。【关键词】smac固相合成肽生物活性线粒体促凋亡蛋白smac（thesecondmitochondrialactivatorofcaspase/directiapbindingproteinac/diablo）作为一种iaps调节蛋白，在凋亡信号的刺激下能促进凋亡的发生，其n端的avpi四肽序列是结合

4、iaps并发挥凋亡作用的重要结构域，其中的ala1残基插入bir3表面凹槽的一个疏水口袋内，以氢键与bir3结合［1］，但smac必须在胞浆中才能行使其功能［2］。.天然的smac的avpi序列短肽不能有效地通过细胞膜，而且有体内不稳定、易降解、利用率低及与xiap亲和力不够等缺点。果蝇触角转录因子是一个很重要的膜调控蛋白，其分子中的短序列rqikikac蛋白的avpi为靶点，fmoc化学法（固相合成法）合成avpiaqk七肽并与具有细胞膜穿透性的果蝇触角因子蛋白转导结构域以脯氨酸（p）相连合成拟smac促凋亡

5、多肽sma7。探讨融合多肽sma7的细胞膜穿透性及其促进低剂量丝裂霉素c诱导的膀胱癌t24细胞凋亡的生物活性，为临床膀胱肿瘤的治疗提供依据。1材料与方法1.1材料各种合成肽单体（西安联美生物科技有限公司），三氟醋酸和乙氰（tedia公司），rpmi1640培养基（gibco公司），胎牛血清（hyclone公司），mtt和dmso（sigma公司），mmc（日本协和发酵株式会社），annexinvfitc凋亡试剂盒(晶美公司)；hoechst33258染色试剂盒（武汉凌飞公司）；hplc(600e，usa)，质

6、谱仪（lcqtm,finnigen,usa），流式细胞仪（facscalibur,bd,usa），酶标仪(biotec,usa),荧光显微镜（nikon,japan）。1.2细胞培养人膀胱癌t24细胞株购于武汉大学物种典藏中心。用含10％胎牛血清、双抗（青霉素、链霉素各100u／ml）的rpmi1640培养基常规培养。1.3融合多肽sma7的设计、合成及纯化以smacn端avpi四肽结构为基础，选择与天然成熟smacavpi结合xiapbir3的kd值相似的七肽avpiaqk为合成序列［4］；具有细胞膜穿透

7、性的果蝇触角因子序列rqikikn，20×50mm）进行纯化，纯度＞95％，旋转蒸发仪真空抽干，低温冷冻干燥后收集结晶物，电子天平称量，1mg/瓶分装，-20℃保存备用。1.4荧光显微镜观察细胞凋亡形态采用hoechst33258染色。t24细胞以0.5×105个／ml接种于6孔板，约60％～80％汇片后，实验组用不同浓度(50、100、200、500μg/l)的sma71640培养基孵育4h后加入终浓度为0.05mg/ml的mmc继续孵育12h、24h、48h。设不加sma7的阴性对照组。4％多聚甲醛固定，p

8、bs洗涤，每孔加入1ml（10μg/ml）hoechst33258染色液，37℃培养15min后荧光显微镜检测。1.5细胞增殖抑制率测定采用四甲基偶氮唑蓝（mtt）比色法。将t24细胞接种于96孔板，每孔2×104个，按实验分组加入不同浓度（50、100、200、500μg/l）的sma7，培养4h后，加入终浓度为0.05mg/ml的mmc，每组设3个复孔，设不加sma7的为阴性对照组