松果体褪黑素对大鼠下丘脑crh神经元的影响

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1、松果体褪黑素对大鼠下丘脑CRH神经元的影响【关键词】松果腺；褪黑激素；下丘脑室旁核；神经元；原位杂交；免疫组织化学　　近年来不少研究发现松果体褪黑素对下丘脑垂体肾上腺轴（hypothalamicpituitaryadrenal，HPA）有明显的调节作用[16]，而该轴分泌的糖皮质激素对机体的免疫功能具有明显的抑制作用，因此很多学者认为松果体褪黑素通过调节HPA轴进而调节免疫功能是其实现免疫调节的一个重要途径。松果体对垂体和肾上腺影响的研究已较为深入，体内、外实验无论从形态和功能方面都证明松果体褪黑素对HPA有调节作用[38]，但迄今

2、为止松果体对下丘脑影响的研究主要停留在松果体褪黑素对下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropinreleasinghormone，CRH)神经元分泌的CRH的影响的水平上。笔者研究是为进一步揭示松果体及褪黑素对免疫功能以及免疫相关性疾病如肿瘤、自身免疫性疾病等的影响机制提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1分组选用2月龄雄性清洁级SD大鼠100只（浙江省实验动物中心，合格证书号：2001001），体质量(200±10）g。标准颗粒饲料，自由摄食饮水，自然光照。随机分为对照组（N组）、假手术对照组（Sham组）、

3、松果体摘除组（M0组）、松果体摘除+褪黑素腹腔注射7.5mg/kg组（M1组）和松果体摘除+褪黑素腹腔注射15mg/kg组（M2组），注射时间为每天17∶00，注射后4，8周取材，M0组动物腹腔注射等量生理盐水。　　1.1.2主要试剂及仪器褪黑素（美国Sigma公司），羊抗CRH多克隆抗体、羊ABC染色系统（美国SantaCruzBiotechnology公司），大鼠CRH原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），大鼠血清CRHELISA试剂盒（美国ADR公司）。牙科涡轮高速牙床（cs181，上海齿科医械厂），手摇切片机（1712，德国Le

4、ica公司），光学显微镜（BH2,日本Olympus公司），酶标检测仪（550,美国BioRad公司），数字显微摄像系统（日本Nikon公司），图像分析系统（JD801，南京捷达公司）。　　1.2方法　　1.2.1动物模型建立及取材选片根据文献[9]，2%戊巴比妥钠麻醉（45mg/kg）后，用牙科涡轮高速牙床，以人字缝为中心五边型磨开颅顶诸骨后摘除松果体。Sham组动物除不摘除松果体外，其余步骤同M0组。于术后4周和8周取全脑，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，取材器械及配溶液所用的双蒸水均用DEPC处理，由于CRH神经元主要分布在下丘脑室旁核（p

5、araventricularnucleus，PVN）后部的小细胞群[10]，故自前连合至乳头体前缘（下丘脑所在范围）行冠状面连续切片，片厚10μm，每隔10片取1片按前后顺序用APES粘片并做苏木素伊红（HE）染色，镜下观察选出所有室旁核后部平面的切片。　　1.2.2下丘脑CRH原位杂交随机选取每只动物室旁核后部3张切片行原位杂交检测CRHmRNA，杂交过程参见试剂盒说明。主要步骤为：3%H2O210min，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶10min,PBS洗后入预杂交液40℃3h,入杂交液（含CRH寡核苷酸探针）40℃过夜，SSC洗涤后加封闭液3

6、7℃30min,入生物素化鼠抗地高辛37℃1h，PBS洗后入SABC37℃20min，PBS洗后加生物素化过氧化物酶37℃20min，PBS洗后DAB显色5min,常规脱水透明封固。以预杂交液代替杂交液作为阴性对照。　　1.2.3下丘脑CRH免疫组织化学染色随机选取每只动物室旁核后部3张切片行ABC法检测CRH，染色过程参见试剂盒说明。主要步骤为：微波修复15min（修复液为柠檬酸盐缓冲液，pH6.0），PBS水洗后入3%H2O210min，入一抗（工作浓度1∶200）4℃冰箱过夜，PBS洗后入生物素化二抗（工作浓度1∶100）1h，PBS洗后

7、入ABC复合物（工作浓度1∶50）30min，PBS洗后DAB显色5min，常规脱水透明封固。以PBS代替一抗作阴性对照。　　1.2.4显微摄像及图像处理分析将免疫组织化学和原位杂交所获得的切片运用数字显微摄像系统进行拍照并运用图像分析软件进行定量检测。　　1.2.5判断标准免疫组织化学和原位杂交染色均以细胞质中出现明显黄色或黄褐色颗粒为阳性表达，每只大鼠共测定3张室旁核后部切片的阳性细胞数、阳性面积和灰度，取均值。　　1.3统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS12.0统计软件。数据行方差分析，组间两两比较用LSD检验进行显著性分析。P&l

8、t;0.05为差别有统计学意义。　　2结果　　2.1松果体摘除及应用外源性褪黑素后下丘脑室旁核CRH神经元转录水平的变化各组的CRH阳性细胞主要分布于