去甲雄三烯醇酮的化学修饰及其免疫原性的构建

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1、去甲雄三烯醇酮的化学修饰及其免疫原性的构建：周成林，苏兆亮，朱卫华，王胜军，李平，许化溪【摘要】　　目的：制备去甲雄三烯醇酮（又称群勃龙，trenbolone，TR）抗体以建立TR特异性检测方法。方法：TR与琥珀酸酐反应生成TR半琥珀酸酯（TRHS），采用混合酸酐法和对乙基N，N二甲基丙基碳二亚胺（EDC）法将TRHS与牛血清蛋白（BSA）偶联制备其偶联物；质谱、核磁共振分析偶联结果；免疫家兔并用双向免疫扩散和ELISA检测抗血清效价，判断偶联物的免疫原性。结果：经质谱鉴定显示，所获得的修饰物

2、TRHS相对分子质量为370；核磁共振分析表明，各吸收峰与理论相符；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图谱分析表明，TRBSA相对分子质量明显增加、紫外最大吸收峰漂移；TR与BSA混合酸酐法和EDC法偶联比分别为1∶18和1∶12；混合酸酐法偶联物免疫家兔获得的抗血清效价ELISA测得TR特异性抗体效价为1∶320000；双向免疫扩散测得的抗血清效价为1∶16。结论:成功制备了具有明显免疫原性的TRBSA偶联物，为TR单克隆抗体的制备和建立TR残留量的快速检测方法奠定了基础。【关键词】去甲雄三烯醇酮

3、；半抗原修饰；偶联；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱　　［Abstract］Objective:Topreparetrenbolone(TR)pleteantigenandidentifytheantigenicityofTR.Methods：TRhalfsuccinate(TRHS)ixedanhydrideandthe［3mercaptopropionicacid,1ethyl3(3diethylaminopropyl)carbodiimide，EDC］methodsseparate

4、dfromrabbitsmunizedolecularinedas370byanalysisofmassspectrometry,theabsorptionpeakagicresonance.MALDITOFMSanalysisshoolecularapofTRBSAamarkedincreaseandtheUVmaximumabsorptionpeakdrift;thecouplingratiosofmixedanhydrideandEDCmethodmunodiffusiontestshoto

5、TRonoclonalantibodypreparationasethodconstructionofTRResiduesrapidtest.　　［Keyodification；coupling；MALDITOFMS　　去甲雄三烯醇酮,又称群勃龙(trenbolone，TR)，是人工合成的甾类男性激素，是家畜的生长促进剂，服用含该激素的肉制品会给人类的身体健康带来危害，同时也成为体育比赛兴奋剂的一个可能。欧盟禁止进口使用该类产品的食品，也是我国海关规定必须检测的31种兽药之一［1］。目前，TR在食品

6、中残留量的检测主要依赖于质谱技术，如气相色谱质谱技术(GCMS)、液相色谱质谱技术(LCMS)等［2］。近年来，随着单克隆抗体技术、现代免疫测定技术的发展，建立方便于基层检验检疫部门应用的快速、灵敏的TR检测方法，对从源头上监测、控制此类物质的扩散具有重要意义［3］。TR是小分子化合物，需要与大分子载体(蛋白质)偶联后才具有免疫原性。本研究采用琥珀酸酐对TR进行化学修饰，并将获得的TR半琥珀酸酯(TRHS)与牛血清白蛋白(BSA)偶联以赋予其免疫原性，经注射家兔分析其免疫效果。　　1材料与方

7、法　　1.1主要材料与仪器　　紫外扫描仪、核磁共振仪、质谱分析仪、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDITOFMS)；BSA、TR等购自Sigma公司；琥珀酸酐、三正丁胺、吡啶、异丙醇均由中国医药集团提供。　　1.2方法　　1.2.1TRHS的制备及鉴定　　1.2.1.1群勃龙结构的修饰　　于烧瓶中加入500mgTR和1000mg琥珀酸酐，然后加入2ml吡啶溶解，80℃搅拌反应3h。反应液冷却至室温，调整其pH为3.0，得棕黄色黏稠物，过夜后变硬。用热的异丙醇重结晶提纯，红外灯烘干即为TR

8、HS(图1)。　　1.2.1.2修饰物的鉴定　　采用质谱法对其相对分子质量进行预测，并用核磁共振鉴定。　　1.2.2TR的抗原性修饰　　1.2.2.1混合酸酐法［4］　　TRHS与BSA按摩尔比100∶1反应。取TRHS5.5mg溶于2ml的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，置4℃冰箱中预冷10min，于冰浴磁力搅拌，加入三丁胺30μl，再加入氯甲酸异丁酯15μl，然后将该溶液置4℃冰箱中反应1h即为反应Ⅰ液；取20mgBSA溶于2m