雄烯二酮耐底物突变株选育及转化条件的优化

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3、生物转化法取代。微生物通过选择性降解甾醇侧链可得甾体药物中间体AD，由于其反应条件温和、周期短、选择立体性强和对环境友好等特点，己被越来越多地运用于甾体药物生产中。但甾体微生物转化过程还存在很多限制因素：甾体化合物在水中的溶解度低、菌株转化能力弱、转化产物不单一、目的产物纯度低以及高浓度底物对菌体生长和产物合成的抑制作用等。本文采用紫外及化学诱变剂相结合的方法对出发菌株M2进行诱变选育，获得一株能在高底物浓度下生长且转化能力较出发菌株提高的突变株MN4，并通过单因素实验与响应面设计对突变株的转化培养基和转化条件进行了优化，进一步提高了菌株的转化能力

4、，主要完成了以下几个方面的研究：(1)对一株能降解植物甾醇侧链生成雄烯二酮的菌株M2进行鉴定。通过对菌株的形态、生理生化特征以及16SrDNA序列进行分析，鉴定该菌为新金分枝杆菌，命名MycobacteriumneoaurumJXNU。(2)采用紫外、硫酸二乙酯对出发菌株进行复合诱变处理，选育高底物耐受性突变株。通过梯度平板法初筛和摇瓶发酵检测，获得一株对底物有较高耐受性的突变株MN4，在底物植物甾醇浓度为20∥L时，AD生成率达40．9％，比出发菌株(25．8％)提高15．1％。对突变株进行遗传稳定性实验，连续传代5次，菌株遗传性状稳定。(3)在

5、获得耐底物突变株的基础上，通过单因素试验和响应面分析法对耐底物突变株MN4的转化培养基进行优化。单因素实验确定培养基的最适碳源、氮源、磷酸盐和无机盐种类，响应面法进一步确定了培养基中各成分的最佳配比：玉米浆2．28％，Nail2P04O．1％，豆油15．32％，葡萄糖0t3％，硝酸钠0．54％。在最佳培养基条件下，当植物甾醇浓度为209／L时，转化144h，突变株AD生成率为52．1％，比原培养基条件下菌株的AD生成率(40．9％)提高27．3％。(4)通过单因素试验对突变株MN4的转化条件进行优化，获得摇瓶发酵的最适转化条件：初始pH7．0，种子

6、培养时间48h，接种量14％，摇床转速230rpm，温度31℃。最佳培养条件下突变株AD生成率为55．2％，比未优化前(52．1％)提高了6％。万方数据(5)在5L发酵罐中进行分批发酵实验，考察发酵过程中pH值、产物浓度和产物生成率随发酵时间的变化。实验表明，在整个发酵过程中，pH值先稍微下降，再上升直至发酵结束，pH值约为8．51；发酵转化90h，AD产量达到最大值9．569／L，此时AD转化率为79．8％。总体来说，小罐发酵AD转化率较高。关键词：新金分枝杆菌；雄烯二酮；植物甾醇；生物转化；诱变育种；优化II万方数据Androst-4．ene．

7、3．17．dioneintermediateinthesynthesisAbstract(AD)，asanimportantofsteroidhormones，WaSrawmaterialandkeyanindispensabledruginclinical．Itcarlbeobtainedbychemicalmethodandmicrobialconversion．Duetothecomplexityofsynthesisprocess，highcost，environmentalpollution，andrawmaterial’Sdryingu

8、pandrisingpricesinrecentyears，chemicalsynthesismethodhasbeenr