高产克拉维酸的耐甘油突变株选育及生理特性研究

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1、高产克拉维酸的耐甘油突变株选育及生理特性研究作者：陈锡永史毓芳王普杨美芬郭子芬【摘要】以带小棒链霉菌XC-1-35为出发菌株，经紫外线照射60s，并结合甘油耐受性菌株的理性筛选，选育得到较佳诱变株XC-5-48，效价达1970μg/ml。该菌株经斜面连续传代4次，效价稳定在1800μg/ml以上。对该菌株的生理特性研究表明，其具有活力较强的甘油特异诱导的甘油转运系统(GTS)。以XC-5-48菌株为试验菌株，当培养基中甘油初始浓度为1.5%，并且在发酵60h时补加1.0%的甘油，摇瓶发酵的效价可达2668μg/ml，较出发菌株(318μg/ml)提

2、高了7.4倍。该工艺应用于15L发酵罐共十个批次的发酵试验，96h时克拉维酸的平均效价达2103μg/ml。【关键词】克拉维酸；生物合成；甘油；菌种选育；菌种特性ABSTRACTTheclavulanicacid-producingstrainStreptomycesclavuligerusXC-1-35lutantXC-5-48lutantnotonlyhadastableproductivityofclavulanicacidaftersubculturingforfourthgenerations,butalsohadactiveglycer

3、oltransportsystem(GTS)umconcentrationof1.5%glycerolinfermentationmediumandfeedingof1%glycerolasprecursorafter60hofincubation,thetiterof2,668μg/mlesparedentationfor96hin15Lfermentor,theaverageyieldreachedto2,103μg/ml.KEYinambres等［5］研究发现，生长在以甘油为唯一碳源的限定培养基中的带小棒链霉菌存在两种不同的转运甘油分子系统：

4、其一是组成型的甘油转运系统；其二是由甘油特异性诱导的甘油转运系统(GTS)，透过细胞90%以上的甘油是由诱导的GTS转运的，其转运能力受到L-丝氨酸等物质的抑制。甘油缺乏时只能合成少量克拉维酸，却大量产生带小棒链霉菌的另一种代谢物头霉素［6］。甘油是生物合成克拉维酸所必需的物质，但当培养基中甘油含量超过110mmol/L时，克拉维酸的生物合成即受到抑制。李丹丹等［7］研究了带小棒链霉菌甘油耐受量与克拉维酸合成的关系，认为耐高甘油浓度的筛选方法可用于克拉维酸菌种的选育。孟勇等［8］以带小棒链霉菌CCRC11518(ATCC27064)为出发菌，采用物

5、理和化学诱变剂处理，通过筛选抗终产物结构类似物舒巴坦钠突变株、底物甘油耐受性突变株、营养缺陷型突变株，获得一株克拉维酸高产突变株III50，摇瓶效价为834.8μg/ml。本文以带小棒链霉菌XC-1-35为出发菌进行紫外诱变，并结合理性化筛选，选育甘油耐受性突变株，改变菌株的生理特性，增强其GTS的活性，使之可高效转运甘油用于合成克拉维酸。同时，针对选育得到的甘油耐受性突变株，通过在发酵过程中补加甘油的方式，进一步提高克拉维酸的产量，取得了较好的研究结果。1材料与方法(1)菌种带小棒链霉菌(Streptomycesclavuli-gerus)XC-

6、1-35，系浙江医药股份有限公司新昌制药厂保藏菌株。(2)培养基及培养条件斜面及平板培养采用高氏1号培养基，28℃培养8～9d。种子培养250ml三角瓶装30ml培养基，置旋转式摇床28℃，220r/min振荡培养48h。培养基成分(g/L)：可溶性淀粉15，甘油15，鱼粉20，CaCO33，pH6.5～7.0。摇瓶发酵250ml三角瓶装30ml培养基，接种量10%，28℃，220r/min振荡培养96h。培养基成分(g/L)：淀粉50，甘油5，黄豆粉30，玉米浆5，CaCl20.1，NaCl0.1，FeSO4·7H2O0.1，MgCl2·6H2O

7、0.1，KH2PO40.8，CaCO33，pH6.5～7.0。(3)分析方法克拉维酸含量测定发酵液采用6mol/L盐酸调pH至3.5～4.0，3500r/min离心10min，去除菌丝体和固体残渣，吸取5ml上清液，12000r/min离心10min后，用重蒸水适当稀释，供HPLC检测。色谱条件为：色谱柱C18，ODS(4.6mm×150mm)，柱温25℃。检测器：Viuambres等［5］认为克拉维酸产生菌中具有两种不同的转运甘油分子系统。其中透过细胞90%以上的甘油是由甘油转运系统(GTS)转运的。GTS是一种分布于细胞膜上的透性酶(转运酶系)

8、，酶活性的最适pH为7.0，最适温度为23～35℃，Km为14μmol/L，半衰期为8h左右。该透性酶的活性中心含有-SH