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时间:2018-05-07
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1、去甲雄三烯醇酮的化学修饰及其免疫原性的构建:周成林,苏兆亮,朱卫华,王胜军,李平,许化溪【摘要】 目的:制备去甲雄三烯醇酮(又称群勃龙,trenbolone,TR)抗体以建立TR特异性检测方法。方法:TR与琥珀酸酐反应生成TR半琥珀酸酯(TRHS),采用混合酸酐法和对乙基N,N二甲基丙基碳二亚胺(EDC)法将TRHS与牛血清蛋白(BSA)偶联制备其偶联物;质谱、核磁共振分析偶联结果;免疫家兔并用双向免疫扩散和ELISA检测抗血清效价,判断偶联物的免疫原性。结果:经质谱鉴定显示,所获得的修饰物
2、TRHS相对分子质量为370;核磁共振分析表明,各吸收峰与理论相符;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图谱分析表明,TRBSA相对分子质量明显增加、紫外最大吸收峰漂移;TR与BSA混合酸酐法和EDC法偶联比分别为1∶18和1∶12;混合酸酐法偶联物免疫家兔获得的抗血清效价ELISA测得TR特异性抗体效价为1∶320000;双向免疫扩散测得的抗血清效价为1∶16。结论:成功制备了具有明显免疫原性的TRBSA偶联物,为TR单克隆抗体的制备和建立TR残留量的快速检测方法奠定了基础。【关键词】去甲雄三烯醇酮
3、;半抗原修饰;偶联;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 [Abstract]Objective:Topreparetrenbolone(TR)pleteantigenandidentifytheantigenicityofTR.Methods:TRhalfsuccinate(TRHS)ixedanhydrideandthe[3mercaptopropionicacid,1ethyl3(3diethylaminopropyl)carbodiimide,EDC]methodsseparate
4、dfromrabbitsmunizedolecularinedas370byanalysisofmassspectrometry,theabsorptionpeakagicresonance.MALDITOFMSanalysisshoolecularapofTRBSAamarkedincreaseandtheUVmaximumabsorptionpeakdrift;thecouplingratiosofmixedanhydrideandEDCmethodmunodiffusiontestshoto
5、TRonoclonalantibodypreparationasethodconstructionofTRResiduesrapidtest. [Keyodification;coupling;MALDITOFMS 去甲雄三烯醇酮,又称群勃龙(trenbolone,TR),是人工合成的甾类男性激素,是家畜的生长促进剂,服用含该激素的肉制品会给人类的身体健康带来危害,同时也成为体育比赛兴奋剂的一个可能。欧盟禁止进口使用该类产品的食品,也是我国海关规定必须检测的31种兽药之一[1]。目前,TR在食品
6、中残留量的检测主要依赖于质谱技术,如气相色谱质谱技术(GCMS)、液相色谱质谱技术(LCMS)等[2]。近年来,随着单克隆抗体技术、现代免疫测定技术的发展,建立方便于基层检验检疫部门应用的快速、灵敏的TR检测方法,对从源头上监测、控制此类物质的扩散具有重要意义[3]。TR是小分子化合物,需要与大分子载体(蛋白质)偶联后才具有免疫原性。本研究采用琥珀酸酐对TR进行化学修饰,并将获得的TR半琥珀酸酯(TRHS)与牛血清白蛋白(BSA)偶联以赋予其免疫原性,经注射家兔分析其免疫效果。 1材料与方
7、法 1.1主要材料与仪器 紫外扫描仪、核磁共振仪、质谱分析仪、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDITOFMS);BSA、TR等购自Sigma公司;琥珀酸酐、三正丁胺、吡啶、异丙醇均由中国医药集团提供。 1.2方法 1.2.1TRHS的制备及鉴定 1.2.1.1群勃龙结构的修饰 于烧瓶中加入500mgTR和1000mg琥珀酸酐,然后加入2ml吡啶溶解,80℃搅拌反应3h。反应液冷却至室温,调整其pH为3.0,得棕黄色黏稠物,过夜后变硬。用热的异丙醇重结晶提纯,红外灯烘干即为TR
8、HS(图1)。 1.2.1.2修饰物的鉴定 采用质谱法对其相对分子质量进行预测,并用核磁共振鉴定。 1.2.2TR的抗原性修饰 1.2.2.1混合酸酐法[4] TRHS与BSA按摩尔比100∶1反应。取TRHS5.5mg溶于2ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,置4℃冰箱中预冷10min,于冰浴磁力搅拌,加入三丁胺30μl,再加入氯甲酸异丁酯15μl,然后将该溶液置4℃冰箱中反应1h即为反应Ⅰ液;取20mgBSA溶于2m
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