经前舒对大鼠海马神经元细胞erβ蛋白和基因表达的影响

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1、经前舒对大鼠海马神经元细胞ERβ蛋白和基因表达的影响【摘要】　　目的观察经前舒颗粒对大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达的影响，探讨经前舒颗粒治疗经前期综合征（PMS）肝气郁证的作用机制。方法以束缚造模法复制PMS肝气郁证大鼠模型，给药组给予调肝方药经前舒颗粒，模型组给予灭菌饮用水，并设不造模正常组，取各处理组血清，对体外培养大鼠海马神经元细胞进行干预；采用蛋白质印迹技术（Sedicatedseruminterveneandinvitroculturehippocampalprimaryneurons;thendetectthe

2、varietyofERβproteinandgeneexpressionprovetheabnormalconditionsoftheexpression.ConclusionTheJingqianshugranulecandoaybeoneofthemechanismtotreatPMS;Neuralcells;EstradiolReceptorbeta　　经前期综合征（premenstrualsyndrome，PMS）肝气郁证是指严重影响正常生活的一组与月经周期密切相关、可预见的经前症状，其主要症状为易激惹、焦虑、抑郁等情

3、绪不稳定的主观症状，其特点为黄体期（月经周期最后两周内）出现症状，月经来潮后症状自行消失［1，2］。PMS肝气郁证是PMS的主要亚型，是肝疏泄不及的表现。经前舒颗粒含白芍、当归、柴胡、白术、丹皮、香附等中药组分具养肝解郁。理气消胀功效，可显著提高PMS肝气郁证临床治愈率。本实验制备大鼠含药血清，并通过Plus、TaqHS（不含dNTPMixture）、RnaseInhibitor、dNTPMixture、RT反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司提供）；引物：ERβ上游F5′-TCACCGTCGAGCCTTAGTTC-3′下游R

4、5′-TCTGCATAGAGGAGCGATGA-3′（286bp）；内参β-actin上游F5′-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′下游R5′-CAAAGAAAGGGTGTAAAACG-3′（552bp）（济南博亚生物工程技术服务有限公司合成）。　　1.4仪器CO2培养箱（上海力新有限公司）；倒置显微镜（中国重庆光电有限公司）；TECAN酶标仪（上海麦莎生物科技有限公司）；721分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；凝胶成像分析仪（上海复日科技有限公司）；PCR扩增仪（TAKARA）。　　2方法　　2.1含药血清的制

5、备筛选动情周期规则的SD大鼠36只进入实验，并随机分为正常组，模型组和给药组，每组12只，饲养于昼夜颠倒环境。根据文献方法［3］并加以改进，将拟造模大鼠（模型组和给药组）前足与对侧后足用无菌纱布捆缚，妨碍其自由活动，以大鼠稍能活动、取食为度。造模同时给药组大鼠给予经前舒颗粒（1ml/100g体质量，相当于人临床8倍剂量［4］）。模型组、正常组大鼠给予相同体积的灭菌饮用水，1次/d，连续5d。造模完毕断头取血，离心，收集血清，-70℃保存。用前56℃、30min灭活，0.45μm微孔滤膜滤菌。　　2.2大鼠海马神经元培养及细胞相

6、对活力测定参考文献方法［5］，取新生SD大鼠大脑海马区进行神经元体外原代培养，MTT检测神经元存活率。将细胞接种在96孔板中，种植浓度1×106/ml，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，分别在培养24，48h后全量换液。细胞分3组，分别加入正常组大鼠血清、模型组大鼠血清、给药组大鼠血清，使其最终浓度为10%（V/V）。细胞培养72h后，每孔加入20μl0.5%MTT溶液；继续培养4h，去上清，每孔加入150μlDMSO，置培养箱15min；用酶标仪于490nm波长测定各孔吸光度值。细胞培养分组及加入大鼠血清（同前），继续培养

7、24h，消化收集对数生长期细胞，PBS洗涤，-70℃放置备用。　　2.3蛋白质免疫印迹技术（Plus总RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA,紫外分光光度仪检测纯度，A260/A280≈1.8，反转录（RT）按照Promega的反转录试剂盒进行操作，PCR扩增条件为：95℃，3min，预变性；94℃，30s，变性；ERβ62℃，内参61.8℃，45s,退火；72℃，1min，延伸；再72℃，7min，延伸。循环参数为：ERβ为33，内参为25。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，应用Smartview生物电泳图像分析系统进行光密度扫

8、描。　　2.5统计方法利用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析及LSD法检验以统计数据，所有数据均用±s表示，显著性水平为P<0.05。　　3.2经前舒颗粒含药血清对大鼠海马神经元ERβ蛋白表达的影响结果见图1及表2。结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清干预的大