铝对大鼠海马组织形态学及细胞凋亡相关基因表达的影响论文

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　　铝对大鼠海马组织形态学及细胞凋亡相关基因表达的影响论文高丽萍程书珍王晓梅贾丽霞【摘要】目的研究三氯化铝对大鼠海马组织形态学及细胞凋亡相关基因表达的影响。方法选择雄性SD大鼠，按体重随机分为4组，在基础饲料中添加三氯化铝，Al3+剂量分别为0、11.2、55.9和111.9mg/kg体重，连续染毒3个月。采用流式细胞仪检测大鼠海马Bcl2、Bax、p53表达，原子吸收法检测海马铝含量，并观察海马病理形态学变化。结果与对照组相比，各染毒组大鼠海马Bcl2表达明显减少(P＜0.05)、Bax、p53表达明显增加(P＜0.05).freelg/kg组大鼠海马颗粒空泡变性细胞明显增多,海马和皮质锥体细胞明显减少,并可见神经原纤维缠结样病理改变。结论铝诱导大鼠出现AD典型的病理改变，其机制可能与Bcl2表达下调及Bax、p53表达上调有关。【关键词】铝；组织形态学；Bcl2；Bax;p53第一高丽萍(1962)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事阿尔茨海默病的研究。阿尔茨海默病(AD)与细胞凋亡的关系已引起人们的重视，在培养细胞、动物模型及AD 病人的尸解中均发现细胞凋亡的证据。研究发现AD患者脑中铝含量普遍增高,过量接触铝会导致AD样记忆力减退、组织器官病理改变和代谢物质的异常变化,提示铝中毒与AD的发生密切相关〔1〕。目前AD的发病机制尚未明确，铝引起大鼠海马组织形态学改变与细胞凋亡相关基因Bcl2、Bax、p53表达的关系报道较少。为此笔者采用氯化铝对大鼠进行亚慢性染毒，研究大鼠海马组织形态学的改变以及与Bcl2、Bax、P53表达变化的关系。1材料与方法1.1动物分组与处理选用北京医科大学实验动物中心提供的体重(350±20)g健康3月龄SD大鼠48只(清洁级，合格证号000004)。采用普通饲料适应性饲养1g/kg体重，中剂量组：55.9mg/kg体重，高剂量组：111.9mg/kg体重，动物自由饮水，动物房温度(20±2)℃。喂饲90d后，从每组随机抓取4只大鼠，采用4%水合氯醛按1ml/100g体重腹腔注射，麻醉后固定大鼠，从大鼠胸骨剑突处开胸，经左心室插管至主动脉，快速灌注0.01mol/L的冷生理盐水100ml冲洗血液，之后用4%多聚甲醛500ml灌注，取脑组织(海马)后立刻固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋用于观察脑组织形态改变。剩余各组大鼠迅速断头处死，在冰块上剥离脑组织，取部分海马准确称重测铝含量，其余海马组织用70%冰乙醇4℃固定，用于流式细胞分析。 1.2脑区病理形态学检查常规石蜡切片，HE染色，观察脑组织形态改变。1.3海马铝含量的测定大鼠海马准确称重后，加入5ml消化液(高氯酸∶硝酸=1∶4)湿法消化，待消化完全后用去离子水定容至25ml,采用TAS990原子吸收分光光度计测铝的含量。1.4Bc12、Bax和p53蛋白表达检测大鼠海马经70%冷乙醇4℃固定24h以上，采用网搓法制备单细胞悬液，取制备好的单细胞悬液约1×106/ml，用PBS液离心洗涤2次，1000r/min离心，每次2min，弃去上清，分别加入1∶100稀释的鼠抗人Bc12单克隆抗体、兔抗人Bax多克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体100μl，在37℃水浴中温育30min；用PBS洗2次，弃上清分别加入1∶100稀释的羊抗鼠FITCIgG及羊抗兔FITCIgG100μl，37℃温育30min，PBS洗涤2次，离心弃上清，除去未结合的多余荧光抗体；上机检测前加入1.0mlPBS液，经400目筛网过滤至样品管中，用流式细胞仪检测。以荧光表达量代表Bc12、Bax和P53基因产物的表达量。1.5数据处理采用SPSS10.0统计软件对数据进行分析。2结果 2.1大鼠脑组织形态学变化在光镜下观察，对照组大鼠皮层、海马细胞排列规则(图1A)。高剂量组大鼠皮层锥体神经元数目明显减少、排列紊乱、层数减少；海马CA1区神经细胞排列紊乱，层数减少，神经元数目减少(图1B)；锥体细胞颗粒空泡变性(图1C)，胶质细胞增多、深染，并可见许多有空晕的固缩细胞(图1D)；CA3区发现许多细胞内有神经纤维缠结(NFT)样改变(图1E)。低剂量与中剂量组大鼠脑组织少数神经细胞也呈现同上病变。2.2大鼠海马铝含量变化给铝盐90d后，3个剂量染毒组大鼠海马铝的含量〔分别为低剂量组:(10.89±3.55)μg/g湿重，中剂量组:(16.9±4.19)μg/g湿重，高剂量组:(23.43±7.51)μg/g湿重，明显高于对照组(5.22±2.81)μg/g湿重〕(P＜0.05)；各染毒组之间海马铝的含量也有显著差异(P＜0.05)，且随染毒剂量的增加而增加(r=0.805，P＜0.01)。2.3大鼠海马神经细胞Bcl2、Bax、p53表达的变化由表1可见，3个剂量染毒组大鼠海马Bcl2表达明显低于对照组(P＜0.05)，Bax、p53表达明显高于对照组(P＜0.05)；各染毒组之间海马Bcl2、Bax、p53表达也有显著差异(P＜0.01)，且随染毒剂量的改变而改变。相关分析表明，AlCl3剂量与Bcl 2、Bax、p53表达有显著相关性(Bcl2、Bax、p53的r值分别为-0.793、0.842、0.812，均P＜0.01)。表1大鼠海马神经细胞Bcl2、Bax、p53表达的变化(略)3讨论大量研究表明，铝的过量接触和体内蓄积可能是导致AD的病因之一。利用铝盐诱导动物产生神经功能性改变，建立AD模型国内外均有报道。以往慢性毒性动物实验常以腹腔注射或灌胃方式为主,与人体实际情况下经水或食物的慢性摄铝方式不符。本研究以食物中添加AlCl3的方式对大鼠进行亚慢性染毒,建立动物模型，病理学检查表明各染毒组大鼠皮质及海马均神经细胞减少、层数减少、排列紊乱、胞核深染、固缩、异型，海马锥体细胞出现了许多颗粒空泡变性，并出现神经原纤维缠结(NFT)等与AD相似的病理特征，其中以高剂量组最为明显。同时随着铝摄入量的增加，铝在海马的富集程度增加，AD患者病理改变最明显的部位也是海马，提示高浓度铝富集是造成大鼠皮质和海马损伤的主要原因。AD的发病机制仍不清楚，细胞凋亡在AD发病中的作用引起人们的高度重视。许多研究表明，AD 脑内神经元的丢失机制与细胞凋亡有关〔2，3〕,细胞凋亡是由基因编程控制的不同于坏死的另一种细胞死亡形式。目前已知有多种基因,如Bcl2、Bax、p53、Cmyc、Fas等均与细胞凋亡有关〔4〕,特别是Bax和Bcl2基因与凋亡的调控关系更为密切〔5，6〕。有研究表明Bcl2基因家族参与了Alzheimer′s介导的神经细胞凋亡〔7〕，伴有DNA片段的神经元中Bcl2表达增加，而伴有NFT的神经元中Bcl2表达减少，提示Bcl2在神经细胞凋亡过程中起重要的调控作用；Bcl2可对抗神经细胞凋亡，在病理过程早期起代偿反应，其确切的机制仍需深入研究。Bax在海马神经元与小胶质神经细胞中表达增加，提示Bax高表达加速NFT形成。Nagy〔8〕研究也认为，AD中Bax高表达与脑内细胞凋亡有关，Bax在NFT形成中起重要的作用。p53被假定为“基因组的卫士”，可防止有DNA损伤的细胞进入S期，从而增加基因的稳定性。有研究表明，AD及其他神经变性疾病中细胞凋亡通过p53及Bax介导，并可能是其神经元丢失的机制之一，其高表达还与老年斑中的Aβ有关。p53基因诱导细胞凋亡的机制可能是降低Bcl2细胞内表达并抑制其功能，提高细胞内Bax的表达，使Bcl2/Bax比例失调而促进细胞凋亡〔9〕。本研究显示，铝可诱导大鼠出现AD典型的病理特征(神经原纤维缠结、颗粒空泡变性和神经元丢失等症状)，且随剂量增加症状渐趋明显，Bcl2表达明显减少，Bax、p53表达明显增加，Bcl 2、Bax、p53表达与AlCl3剂量有显著相关性，表明铝诱导大鼠出现AD典型的病理特征，其机制可能与Bcl2表达下调，p53、Bax表达上调有关。【