流式微球载体技术在检测肾综合征出血热患者血清特异性抗体和细胞因子中的应用

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1、流式微球载体技术在检测肾综合征出血热患者血清特异性抗体和细胞因子中的应用【摘要】　　目的:建立流式微球载体技术（FMA）检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清抗HFRS病毒特异性抗体IgM和IgG及细胞因子含量的新方法。方法:选择28例临床确诊的HFRS患者及20例健康人血清标本,FMA定量检测抗HFRS病毒IgM和IgG;定量检测细胞因子IL6和TNFα。检测结果与ELISA法进行比较。结果:FMA检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为92.85%和71.43%,健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0;HFRS

2、患者血清IL6和TNFα的含量分别为(532.62±397.19)ng/L和(392.68±177.68)ng/L,明显高于健康对照组（38.77±20.32）ng/L（P<0.01）和(15.91±6.91)ng/L（P<0.01）。ELISA法检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为71.43%和50.00%,健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0;HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分别为(256.46±102.51)ng/L和(45.63±5.32)ng/L,高于健康对照组(53.8±19.2

3、1)ng/L（P<0.01）和(5.81±3.58)ng/L（P<0.01）。结论:建立了FMA法对HFRS患者的特异性抗体和IL6和TNFα的检测,其灵敏度明显优于ELISA法,为HFRS的临床诊断和病理机制研究提供了新的方法。【关键词】肾综合征出血热;IL6;TNFα;流式细胞术;免疫酶技术　　［Abstract］AIM:Toestablishafloicrobeadsassay(FMA)toexaminethelevelofhemorrhagicfeverevirus(HFRSV.)specificIgM,IgGa

4、ndcytokinesinHFRSpatients.METHODS:Serumsamplesfrom28casesofHFRSand20healthycontrolslevelsofantiHFRSV.antibodiesmatorycytokinesIL6andTNFαlevelofIL6andTNFαinHFRSgrouplevelofIL6andTNFαinHFRSgroupethodisestablishedtomonitortheimmuneresponseinHFRSpatients,orrhagicfevere;I

5、L6;TNFα;Floetry;immunoenzymetechnology　　肾综合征出血热（hemorrhagicfevere,HFRS）是由HFRS病毒引起的自然疫源性急性病毒性传染病。临床上,检测特异性IgM、IgG和细胞因子的方法仍以ELISA法为主,该技术是以包被在酶板上的抗原(或抗体)与标本中的抗体（或抗原）反应,形成抗原抗体复合物,再用酶标二抗和酶底物显色,通过酶标仪检测。该方法的灵敏度存在缺陷,并且是一种非均相法检测,必需将未结合的抗体和酶标二抗分离出去后才能进行读数,因而增加了操作时间、操作步骤和系统误差。　　

6、流式微球载体技术(floicrobeadsassay,FMA)是利用流式细胞术（FCM）和高聚分子微球载体技术检测可溶性生物分子的新技术。原理是在聚苯乙烯微球上进行抗原抗体反应,用荧光物质标记的二抗为示踪剂,通过流式细胞仪进行检测。该方法灵敏度高,可作均相法分析,减少了操作步骤和时间。我们采用FMA检测HFRS患者血清中特异性IgM、IgG及细胞因子含量,并与ELISA方法进行了比较。　　1材料和方法　　1.1材料　　陕西省疾病预防控制中心病毒研究室提供的HFRS患者血清28例,其中男18例,女10例,年龄17～52岁,平均年龄3

7、0.6岁。FACSCalibur流式细胞仪、荧光校准微球（FloL,分离血清,-20℃保存。（2）检验方法:①管1空白对照:只加微球载体。管2零标准管:加微球载体和标记抗体。管3阴性对照。管4阳性对照。管5此管开始为待测样本管。②加微球载体:各管加样本稀释液100μL。所有管加微球载体10μL/管,轻柔震荡混匀。③加待测样本:管3加阴性对照10μL、管4加阳性对照10μL。待测样本管加待侧样本10μL,轻柔震荡混匀,置2～8℃孵育20min。④清洗离心:加PBS4mL/管,3000g离心6min。弃上清,存留管底微球沉淀约100μL

8、。⑤标记从管2开始,各管加标记抗体10μL,震荡混匀,置2～8℃、避光20min。⑥分析每管加PBS0.4mL,轻柔震荡混匀后上流式细胞仪分析:上机检测前,用荧光校准微球校正流式细胞仪光路和流路,使变异系数值（CV）在2.0之内。依次