急性肝衰竭大鼠肝组织中钙蛋白酶-钙蛋白酶抑制蛋白的表达及乌司他丁对其的影响

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1、急性肝衰竭大鼠肝组织中钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的表达及乌司他丁对其的影响：商振球，陈永平，谷甸娜【摘要】目的：探讨钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白在急性肝衰竭模型中的表达情况及乌司他丁对其表达的影响。方法：通过腹腔注射D-氨基半乳糖（D-Gal）及脂多糖（LPS）建立大鼠急性肝衰竭模型。大鼠随机分为对照组、模型组及乌司他丁干预组。采用免疫组织化学方法检测钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白表达情况。结果：D-Gal/LPS联合注射成功诱导大鼠急性肝衰竭模型，与对照组相比，模型组钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白表达增加（P<0.05），但经乌司他丁干预后，钙蛋白酶表达较模型组明显减少（P<0

2、.05），而钙蛋白酶抑制蛋白的表达无明显变化（P＞0.05）。结论：乌司他丁可能通过抑制钙蛋白酶活性，同时保持钙蛋白酶抑制蛋白活性，从而减轻肝脏炎症损伤。【关键词】乌司他丁；钙蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；肝功能衰竭；急性　　Abstract:Objective:Toexplorethechangesofexpressionofcalpainandcalpastatininacuteliverfailure，andtoevaluatetheeffectsofulinastatinontheexpressionsofcalpain/calpastatin.Methods:Themodel

3、ofacuteliverfailure(ALF)ine(D-Gal)andlipopolysaccharide(LPS).Sixty-sixSpragueDalyintothreegroups:controlgroup，ALFgroup(modelgroup)andulinastatingroup(interventiongroup).Hepaticsamplesmunohistochemistry.Results:paredodelgroupandtheinterventiongroupincreasedsignificantly(P<0.05).Hoarginallylo

4、odelgroup(P<0.05)，andthereodelgroupandinterventiongroup(P>0.05).Conclusion:ThesefindingssuggestthatulinastainprovidescriticalprotectionagainsttheliverinjuryinducedbyD-Gal/LPS.Moreover，theeffectislikelyduetothedecreasedexpressionofcalpainandpreservedthelevelofcalpastatin　　KeyL；模型组：30只，分为6

5、、12、24、36和48h5个亚组，每组6只；干预组:30只，分为6、12、24、36和48h，5个亚组，每组6只。　　1.2主要试剂　　内毒素（LPS）购自北京宝希迪科技有限公司，D-氨基半乳糖（D-Gal）购自南通通吕生物制品有限公司，乌司他丁购于广东天普生化医药有限公司，兔抗大鼠CalpainI多克隆抗体购于英国Abcam公司，兔抗大鼠Calpastatin（H-300）多克隆抗体购于美国SantaCruzBio-technology公司，二步法免疫组化检测试剂和DAB显色盒购于北京中杉金桥公司。　　1.3实验方法[2]　　将D-Gal溶于无菌0.9%NaCl溶液，用1mol

6、/LNaOH调pH7.0，按800mg/kg体质量给予大鼠腹腔注射，同时配制脂多糖（LPS）溶液，按40μg/kg体质量腹腔注射；乌司他丁干预组：30只，乌司他丁注射液每10万单位溶于2mL无菌0.9%NaCl溶液中，造模后30min腹腔注射，每千克体质量10万单位，造模药物剂量与亚组处理同模型组。上述各组动物在注射药物后在不同时间点，经10%水合氯醛0.35mL/kg麻醉后，开腹取肝组织，于10%中性甲醛溶液固定，待病理及免疫组织化学检测。　　1.4免疫组织化学与苏木精-伊红染色　　石蜡包埋4μm切片，采用二步法，经脱蜡，抗原微波修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，加钙蛋白酶

7、一抗（1:100稀释，兔抗Calpain1-DomianIV多克隆抗体IgG，和1:50稀释兔抗Calpastatin多克隆抗体IgG）4℃温育过夜，加二抗（PV-6001，山羊抗或兔IgG抗体-HRP多聚体，购于北京中杉金桥）37℃水浴箱30min，二氨基联苯胺（DAB）显色2min，苏木精复染2min，氨水返蓝，脱水、二甲苯透明，封片，镜检。在阳性标本上以PBS代替一抗作为阴性对照。用Image-ProPlus6.0图像分析系统测量肝组织平均积分光密度（IODSU