急性肝衰竭大鼠肝组织中钙蛋白酶-钙蛋白酶抑制蛋白的表达及乌司他丁对其的影响论文

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1、急性肝衰竭大鼠肝组织中钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的表达及乌司他丁对其的影响论文商振球，陈永平，谷甸娜【摘要】目的：探讨钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白在急性肝衰竭模型中的表达情况及乌司他丁对其表达的影响。方法：通过腹腔注射D-氨基半乳糖（D-Gal）及脂多糖（LPS）建立大鼠急性肝衰竭模型。大鼠随机分为对照组、模型组及乌司他丁干预组。采用免疫组织化学方法检测钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白表达情况。结果：D-Gal/LPS联合注射成功诱导大鼠急性肝衰竭模型，与对照组相比，模型组钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白表达增加（P0.05）

2、，但经乌司他丁干预后，钙蛋白酶表达较模型组明显减少（P0.05），而钙蛋白酶抑制蛋白的表达无明显变化（P＞0.05）。结论：乌司他丁可能通过抑制钙蛋白酶活性.freelodelofacuteliverfailure(ALF)ine(D-Gal)andlipopolysaccharide(LPS).Sixty-sixSpragueDalyintothreegroups:controlgroup，ALFgroup(modelgroup)andulinastatingroup(interventiongroup).He

3、paticsamplesmunohistochemistry.Results:paredodelgroupandtheinterventiongroupincreasedsignificantly(P0.05).Hoarginallyloodelgroup(P0.05)，andthereodelgroupandinterventiongroup(P0.05).Conclusion:Thesefindingssuggestthatulinastainprovidescriticalprotectionagainst

4、theliverinjuryinducedbyD-Gal/LPS.Moreover，theeffectislikelyduetothedecreasedexpressionofcalpainandpreservedthelevelofcalpastatinKeyL；模型组：30只，分为6、12、24、36和48h5个亚组，每组6只；干预组:30只，分为6、12、24、36和48h，5个亚组，每组6只。1.2主要试剂内毒素（LPS）购自北京宝希迪科技有限公司，D-氨基半乳糖（D-Gal）购自南通通吕生物制品有限公司

5、，乌司他丁购于广东天普生化医药有限公司，兔抗大鼠CalpainI多克隆抗体购于英国Abcam公司，兔抗大鼠Calpastatin（H-300）多克隆抗体购于美国SantaCruzBio-technology公司，二步法免疫组化检测试剂和DAB显色盒购于北京中杉金桥公司。1.3实验方法2将D-Gal溶于无菌0.9%NaCl溶液，用1mol/LNaOH调pH7.0，按800mg/kg体质量给予大鼠腹腔注射，同时配制脂多糖（LPS）溶液，按40μg/kg体质量腹腔注射；乌司他丁干预组：30只，乌司他丁注射液每10万单位

6、溶于2mL无菌0.9%NaCl溶液中，造模后30min腹腔注射，每千克体质量10万单位，造模药物剂量与亚组处理同模型组。上述各组动物在注射药物后在不同时间点，经10%水合氯醛0.35mL/kg麻醉后，开腹取肝组织，于10%中性甲醛溶液固定，待病理及免疫组织化学检测。1.4免疫组织化学与苏木精-伊红染色石蜡包埋4μm切片，采用二步法，经脱蜡，抗原微波修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，加钙蛋白酶一抗（1:100稀释，兔抗Calpain1-DomianIV多克隆抗体IgG，和1:50稀释兔抗Calpastatin

7、多克隆抗体IgG）4℃温育过夜，加二抗（PV-6001，山羊抗或兔IgG抗体-HRP多聚体，购于北京中杉金桥）37℃水浴箱30min，二氨基联苯胺（DAB）显色2min，苏木精复染2min，氨水返蓝，脱水、二甲苯透明，封片，镜检。在阳性标本上以PBS代替一抗作为阴性对照。用Image-ProPlus6.0图像分析系统测量肝组织平均积分光密度（IODSUM），用以代表阳性部位蛋白表达水平。1.5统计学处理方法采用单因数方差分析。方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dun’sT3检验。2结果2.1免疫组织化

8、学结果显示，在正常肝组织中，肝实质细胞少量表达钙蛋白酶；在D-Gal/LPS联合作用后，肝细胞中钙蛋白酶阳性表达逐步增加，36h到达高峰；而乌司他丁干预组钙蛋白酶表达较模型组明显减少（P0.05），见图1；与对照组相比，模型组钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白表达增加（P0.05）；钙蛋白酶平均积分光密度见表1。2.2钙蛋白酶抑制蛋白在正常肝脏组织中有少量表达。造模后，其表达与钙