抗hbs mab的研制及其对野生与免疫逃逸变异 hbsag的交叉反应特征

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1、抗HBsmAb的研制及其对野生与免疫逃逸变异HBsAg的交叉反应特征：李方和,张小燕,严兵△,张波,黄永国,张春燕,龚劲松,陈妍,刘静华【摘要】　　目的:抗HBsG6mAb制备及其对重组野生与免疫逃逸变异HBsAg结合能力与特点的评价。方法:常规制备并纯化抗HBsmAb,以纯化抗HBsmAbIgG包被,采用ELISA对17种野生及“a”决定簇替代性变异全基因重组表达HBsAg进行检测,并与几种市售HBsAg检测试剂进行比较。结果:该杂交瘤细胞生长与分泌特性稳定,其培养上清与腹水效价分别为2048及4096×103;对野生HBsAg检测（ELISA）敏感性不低于0.125μg/L。该抗体可与1

2、5种变异抗原中12种发生反应（P/N≥2.5）,反应信号强度分别为低反应组（2份,与野生株A值比较,下同）平均7.55%;中反应组（1例）为59.40%;高反应组（9种）分别为野生株的92.1%～109.4%,低反应或无反应表达产物的免疫逃逸变异部位集中在HBV“a”决定簇I环的起始部即120～124序列之间。部分表达产物采用市售试剂作同步检测,平均显色强度高于或明显高于几种国内应用最为普遍的HBsAgELISA（P<0.05)。结论:抗HBsG6mAb对多数免疫逃逸变异HBsAg有很强的结合能力,所针对的变异类型亦表现出某种特殊的规律。【关键词】乙型肝炎病毒基因变异HBsAg免疫逃逸

3、ELISA　　[Abstract]AIM:TopreparemonoclonalantibodiesagainstHBsAgandestimateitsbindingcapacitytobothmuneescapemutanttypeHBsAg.METHODS:UsingselfmadetheantiHBsG6mAbandHRPlabeledgoatantiHBsantibody,AsandmuneescapemutanttypeHBsAghasbeendeveloped.Applyingthisassay,todetect17speciesofinant.toevaluatei

4、tsclinicalapplicationcharacteristicofthisassay,ercialreagentstoparingacelllinsecretedantiHBsmAb(definedG6),AbcanbindutantHBsAg(P/N≥2.5),and2ofthem(A450)groupiddleA450valuegroupinant.S）。由于这类变异病毒在体内不能为针对野生HBV的保护性免疫中和,在体外其HBsAg不能为多数现行市售试剂所检出,其存在势必造成部分HBV感染者临床诊断困惑,献血员筛查漏检,及其血清流行病学调查失真,已受到国内外学者的广泛关注[2,

5、3]。所在单位自上世纪末即高度关注这一现象,并为此进行大量的研究。新近又获得一株能与多数免疫逃逸变异（IEM）HBsAg有极强结合能力的单克隆抗体（细胞克隆序号G6B3F1,分泌物简称抗HBsG6mAb）,并对其与HBV“a”决定簇变异重组表达产物的结合特征进行了初步的评价。　　1材料和方法　　1.1材料BALB/c小鼠由湖北省疾病预防控制中心动物室提供;HBVDane颗粒、全基因重组野生HBsAg及Al(OH)3凝胶由卫生部武汉生物制品研究所提供;Sp2/0细胞由中国典型培养物保藏中心提供;RPMI1640培养基购自Gibco公司;PEG、HAT、HT以及鼠免疫球蛋白亚类检测试剂等购自Si

6、gma公司;羊抗鼠IgG及HRP标记的羊抗鼠IgG购自美国Pierce公司;HRP标记羊抗HBs、部分HBsAgELISA试剂盒自市售获得;抗HBsA11mAb与抗HBsMtmAb由中科院武汉病毒研究所提供;乙肝病毒G145R变异表面抗原由本室既往制备;其他多种野生与IEM重组全基因S蛋白表达产物（表1）由本院临床免疫研究室收集并提供。　　1.2方法　　1.2.1抗HBsG6mAb的制备按文献报道[4]。常规免疫小鼠,融合及有限稀释法制备杂交瘤细胞;降植烷诱导法制备腹水;采用紫外比色（以BSA为标准）测定腹水中总蛋白含量。抗HBsG6mAbIgG的纯化采用辛酸硫酸铵沉淀法。　　1.2.2G

7、6ELISA的建立采用纯化抗HBsG6mAbIgG包被,羊抗HBsHRP示踪,建立双抗体夹心ELISA。主要操作为(1)将抗HBsG6mAbIgG以pH9.6的碳酸缓冲液稀释,加入酶标反应板各孔中,4℃放置过夜;（2）以PBST洗涤5次,加入20g/LBSA（150μL/孔）,置37℃2h,甩干;（3）加入待测或对照标本（100μL/孔）,37℃反应30min;（4）同上洗板,每孔加入100μL羊抗HBs