免疫荧光双标记技术检测胎盘hbsag┐抗┐hbs复合物

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1、免疫荧光双标记技术检测胎盘HBsAg┐抗┐HBs复合物　　摘要:目的探讨乙肝病毒（HBV）以何种形式感染胎盘滋养层细胞.方法通过免疫荧光双标记技术检测12例血清HBsAg阳性母亲的胎盘滋养层细胞HBsAg-抗-HBs复合物.结果血清学HBsAg阳性母亲胎盘滋养层细胞中存在HB-sAg-抗-HBs复合物.结论提示HBV可能通过HBsAg与抗-HBs结合成复合物的方式进入胞内，导致胎盘屏障的第一层细胞受到HBV感染.　　KeyHepatitisBVirus（HBV）takesintheinfectionofthefirstlayercellofplacentabarrier-tropho

2、blastcells.METHODSHBsAg-anti-HBsplexesinHBsAgseropositivematernalplacentatissuesmunofluorenscencemethodvisualizedicroscope.RESULTSHBsAg-anti-HBsplexesainlyontro-phoblastcells（TC）ofHBsAgseropositivematernalplacentatissues.CONCLUSIONHBsAgandanti-HBsareformedasHBsAg-anti-HBsplexesbeforeentryintotr

3、ophoblastcells，ayresultintheinfectionofthefirstlayercellofplacentabarrier.　　0引言　　乙型病毒肝炎是严重危害我国人民健康的传染病.乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性的孕妇可将乙肝病毒（HBV）经胎盘传给胎儿，这种传播称为HBV的宫内传播.现在普遍认为，胎盘在HBV宫内感染中起重要作用，认为HBV是先感染胎盘然后才引起胎儿感染的，我室既往用免疫组织化学和原位杂交方法对101例血清学HBsAg阳性胎盘组织检测了HB-sAg和HBVDNA，其中滋养层细胞HBsAg阳性率为40.6%（41/101），发现HBsAg主

4、要分布于胞质［1］.国外学者在3例HBsAg慢性携带者胎盘绒毛基质血管内、滋养层细胞等检测到HBsAg［2］.可见胎盘滋养层细胞受到HBV感染已毋庸置疑，但HBV是如何进入滋养层细胞的确切机制国内外尚未见报导.本研究通过对胎盘组织HBsAg-抗-HBs复合物的检测，试图阐明HBV是以何种方式跨越胎盘屏障进入滋养层细胞，为进一步揭示其宫内传播机制提供依据.　　1材料和方法　　1.1材料　　1997/1998年太原市传染病院妇产科收集HBsAg阳性足月分娩产妇静脉血3～5mL及胎盘组织，静脉血分离血清后贮存于-20℃冰箱，统一进行HBsAg，HBsAg复查.用手术刀切取约1.5cm×1c

5、m×2cm大小的胎盘组织（包括母面及胎儿面）浸入40g・L-1多聚甲醛中固定后常规石蜡包埋.从以上收集的胎盘标本中选择ABC和免疫荧光组织化学检测为HBsAg阳性的胎盘标本12例.鼠抗-HBs购于武汉博士德生物工程有限公司（BioGenex产品，克隆号:A34060259P，Cat.No:MU364-UC）;FITC标记的HBsAg自制（HBsAg购于北京医科大学肝病研究所，从HBsAg携带者血浆中提取，经浓缩后，用FITC进行标记）;生物素化兔抗鼠IgG购于博士德，产品编号:SA1072，Avidin标记的TexasRed购于基因公司（MolecularProbes产

6、品，CatalogNo:A-2665）.用正常鼠血清代替鼠抗-HBs及FITC标记的HBsAg作为抗体特异性对照;用PBS代替抗-HBs及FITC标记的HBsAg作为空白对照;另外用血清学检查HBV感染标记全阴性胎盘组织作为正常阴性对照.　　1.2方法　　1.2.1HBsAg的检测　　切片常规脱蜡（二甲苯、梯度乙醇）水化后，加入1∶50稀释的鼠抗-HBs单抗，4℃过夜.PBS振洗后，再加入1:50稀释的生物素化的兔抗鼠IgG37℃60min，最后加入1∶1000稀释的Avidin标记的TexasRed，37℃孵育数小时，PBS充分洗涤，用无荧光缓冲甘油封片后，直接在激光共聚焦显微镜（

7、LSCM）上观察并拍照.所用LSCM型号为Bio-RadMRC-1024，用于TaxasRed的激发波长为568nm.　　1.2.2抗-HBs的检测　　切片同上脱蜡水化后，加入1∶20稀释的FITC标记的HBsAg.37℃孵育数小时，PBS充分洗涤，激光共聚焦显微镜（LSCM）上观察并拍照，用于FITC的激发波长为488nm.　　1.2.3HBsAg-抗-HBs复合物的检测　　切片经常规脱蜡水化后，加入3mol・L-1尿素，室温30min后，