光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的dna结

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1、光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结【摘要】利用荧光滴定法研究了9种金属离子与序列特异性的DNA结合结构域(p53DBD)的结合反应，其结合能力依次为Fe3+>Zn2+>Cu2+>Ca2+>Mg2+>Ba2+>Mn2+>Ni2+>Co2+。圆二色谱研究结果表明，Ba2+,Ca2+,Co2+,Mn2+及Ni2+并未引起蛋白二级结构变化;　Zn2+,Mg2+及Fe3+诱导蛋白结构细微调整;而Cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失。ANS结合研究结果表明,Mg2

2、+与Zn2+相似，诱导p53DBD蛋白表面疏水性增强，而Fe3+引起p53DBD蛋白表面疏水性降低。因此，Mg2+和Fe3+可能是影响或调节p53活性的潜在因子之一。【关键词】金属离子,蛋白结构,亲和性,疏水性,荧光光谱　　1引言　　自然界中大约1/4的蛋白需要金属离子的协助才能发挥正常功能[1,2]。肿瘤抑制蛋白p53是Zn2+结合蛋白，它调控很多重要的生物学过程[3]。p53响应于多种DNA损伤事件，被激活后作为一个转录因子进一步激活下游基因，从而可以导致细胞周期停留在G1/S期修复或者诱导凋亡[4]。所有这

3、些已知的生物学功能都依赖于其DNA结合特性[5]。野生型p53通过一个序列特异性的DNA结合结构域(p53DBD)来结合DNA[6]。p53基因在50%肿瘤中发生突变[7]，而这些突变主要发生在p53DBD，突变的p53不能激活下游基因转录[8]。因此，p53DBD结合和转录激活活性是p53最关键的生物学功能。晶体结构研究结果表明，p53核心结构域结构为β三明治结构形成脚手架，支撑2个大环和1个环片层螺旋模序。2个大环形成空腔结合Zn2+，而环片层螺旋模序形成p53DNA结合表面。p53DBD上的3个半

4、胱氨酸(Cys176,Cys238和Cys242)和1个组氨酸(His179)结合1个Zn2+[9]。Zn2+的结合被认为是p53核心结构域正确折叠所必需的，这种结合如果被破坏将会使p53DBD减弱甚至失去DNA结合和转录下游基因的功能[10]。核磁共振研究表明：在没有Zn2+的情况下，p53蛋白的DNA结合表面发生了结构变化;荧光各向异性研究表明：Zn2+的去除使p53DBD失去了位点特异性的DNA结合活性，但保留着非特异性的DNA结合活性[11]。另外，Cu2+结合p53蛋白，却导致p53构象和DNA结合活性

5、的破坏[12]。然而，金属离子与p53DBD的结合平衡的研究尚未见报道。　　细胞内存在多种金属离子，为了研究这些金属离子是否结合并影响p53DBD，本实验克隆并纯化了p53DBD蛋白，并在体外应用光谱法研究这些金属离子与p53DBD蛋白的结合反应，以及金属离子对蛋白结构及表面疏水性的影响。2实验部分　　2.1仪器与试剂　　F4500荧光分光光度计(日本日立公司);JascoJ715分光偏振计(日本分光株式会社)。8苯胺1萘磺酸(ANS，Sigma公司);二硫苏糖醇(DTT，Merck公司);NaCl(天

6、津市试剂六厂);蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、TrisBase及咪唑均购于北京鼎国试剂公司;ZnCl2,MgCl2,CaCl2,FeCl3,MnCl2,CoCl2,CuCl2,BaCl2及NiCl2均购于天津大学科威公司。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。　　高渗缓冲液A(20mmol/LTrisHCl，2.5mmol/LEDTA，200g/L蔗糖，pH8.0);低渗缓冲液B(20

7、mmol/LTrisHCl，2.5mmol/LEDTA，pH8.0);缓冲液C(20mmol/LTrisHCl，50mmol/LNaCl，2mmol/LCaCl2，pH8.0);缓冲液D(0.5mol/LNaCl，20mmol/LTrisHCl，5mmol/L咪唑，pH8.0);缓冲液E(0.5mol/LNaCl，20mmol/LTrisHCl，80mmol/L咪唑，pH8.0);缓冲液F(0.5mol/LNaCl，20mmol/LTrisHCl，300mmol/L咪唑，pH8.0);缓冲液G(50mm

8、ol/LTrisHCl，100mmol/LNaCl，1mmol/LDTT，pH7.5)。　2.2p53DBD的基因克隆、蛋白表达与纯化　　利用密度梯度离心法从人全血中分离单个核细胞，然后使用TRIzol法从单个核细胞中提取总RNA。以5′TCCCAAGCAATGGATGAT3′和5′TTTATGGCGGGAGGTAGA3′为引物，通过RTPCR方法从总RNA中