光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的dna结合结构域的相互作用论文

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1、光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合结构域的相互作用论文【摘要】利用荧光滴定法研究了9种金属离子与序列特异性的DNA结合结构域(p53DBD)的结合反应，其结合能力依次为Fe3+Zn2+Cu2+Ca2+Mg2+Ba2+Mn2+Ni2+Co2+。圆二色谱研究结果表明，Ba2+,Ca2+,Co2+,Mn2+及Ni2+并未引起蛋白二级结构变化;Zn2+,Mg2+及Fe3+诱导蛋白结构细微调整;而Cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失。ANS结合研究结果表明,Mg2+与Zn2+相似，诱导p53DBD蛋白表面疏水性增强，而Fe3+引起p53DBD蛋白表面疏水性

2、降低。因此，Mg2+和Fe3+可能是影响或调节p53活性的潜在因子之一。【关键词】金属离子,蛋白结构,亲和性,疏水性,荧光光谱1引言自然界中大约1/4的蛋白需要金属离子的协助才能发挥正常功能1,2。肿瘤抑制蛋白p53是Zn2+结合蛋白，它调控很多重要的生物学过程3。p53响应于多种DNA损伤事件，被激活后作为一个转录因子进一步激活下游基因.freela公司);二硫苏糖醇(DTT，Merck公司);NaCl(天津市试剂六厂);蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、T

3、risBase及咪唑均购于北京鼎国试剂公司;ZnCl2,MgCl2,.freelmol/LTrisHCl，2.5mmol/LEDTA，200g/L蔗糖，pH8.0);低渗缓冲液B(20mmol/LTrisHCl，2.5mmol/LEDTA，pH8.0);缓冲液C(20mmol/LTrisHCl，50mmol/LNaCl，2mmol/LCaCl2，pH8.0);缓冲液D(0.5mol/LNaCl，20mmol/LTrisHCl，5mmol/L咪唑，pH8.0);缓冲液E(0.5mol/LNaCl，20mmol/LTrisHCl，80mmol/L咪唑，p

4、H8.0);缓冲液F(0.5mol/LNaCl，20mmol/LTrisHCl，300mmol/L咪唑，pH8.0);缓冲液G(50mmol/LTrisHCl，100mmol/LNaCl，1mmol/LDTT，pH7.5)。2.2p53DBD的基因克隆、蛋白表达与纯化利用密度梯度离心法从人全血中分离单个核细胞，然后使用TRIzol法从单个核细胞中提取总RNA。以5′TCCCAAGCAATGGATGAT3′和5′TTTATGGCGGGAGGTAGA3′为引物，通过RTPCR方法从总RNA中克隆出肿瘤抑制蛋白p53cDNA片段。然后以5′ATCGTC

5、TCCCATGGCTGTCCCTTCCCAGAAAACCT3′和5′ATATCTCGAGTCACAGTGCTCGCTTAGTGCTC3′为引物PCR编出氨基酸96～308的p53DBD基因片段。这个基因片段被克隆进表达载体pET32a(novagen)。重组质粒通过碱裂解法制备，测序证明插入序列的正确性。核心的DNA结合结构域在EscherichiacoliBL21(DE3)trxB-中过量表达。细菌在LB培养基中37℃培养直到吸光度值A600达到0.6～1.0。用0.25mmol/L异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，25℃条件

6、下继续孵育6h。后续的步骤都在4℃下进行。离心收集菌体，然后重悬于高渗缓冲液A中30min。离心重新收集后，细菌溶解在低渗缓冲液B中裂解45min。不溶物以13000r/min离心30min去除。蛋白上清液用缓冲液C透析12h，然后流经缓冲液D平衡的亲和色谱柱(qiagen)。色谱层析后用缓冲液E清洗杂蛋白，用缓冲液F洗脱重组蛋白。洗脱的蛋白组分利用SDSPAGE检测。重组的p53DBD蛋白进一步利用SephadexG75凝胶过滤柱(pharmacia)于缓冲液C中纯化。从凝胶过滤柱中收集的蛋白用肠激酶在25℃下酶切7h。酶切蛋白再次利用SephadexG

7、75凝胶过滤柱于缓冲液G(50mmol/LTrisHCl,pH7.5,100mmol/LNaCl,1mmol/LDTT)中进一步纯化。纯化的p53DBD蛋白用2.5mmol/LEDTA处理以去除Zn2+，然后流经SephadexG75凝胶柱更换缓冲液为缓冲液G。最后SDSPAGE电泳检测纯度，运用Bradford法以牛血清白蛋白为标准测定蛋白浓度。2.3荧光滴定在室温条件下，以295nm为激发波长，记录310～450nm的发射谱。激发和发射的光谱带宽设置为5nm，每个数据点测量3次。蛋白浓度为1.8μmol/L，滴定反应于缓冲液G中进行。每个数据点都扣除背

8、景，作荧光校正。2.4圆