利用rna干扰技术抑制单胺氧化酶b 基因的表达

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1、利用RNA干扰技术抑制单胺氧化酶B基因的表达【摘要】目的确定并筛选用于特异静默单胺氧化酶B(MonoamineOxidaseB，MAOB)基因的干扰小RNA(siRNA)片段，建立RNA干扰技术平台。方法构建含单胺氧化酶B基因siRNA片段的pSilencer1.0-U6siRNA表达质粒，转染Hela细胞，用RT-PCR和定量PCR方法检测单氨氧化酶BmRNA的水平。结果所设计的两段siRNA片段均有干扰MAOBmRNA水平的作用，片段2的作用优于片段1，两个片段之间有一定的协同作用。结论选择的siRNA片段可以抑制Hela细胞单胺氧化酶B

2、的表达。【关键词】RNA干扰，单氨氧化酶B；基因单胺氧化酶B(MonoamineOxidaseB，MAOB)是一种线粒体酶，在脑内主要存在于基底核和中脑的神经元中，参与多巴胺代谢并被认为与神经退行性疾病帕金森氏症有关［1］。其抑制剂如Deprenyl、Eldepryl、Selegiline等是常用的抗抑郁药物和神经保护药物，所有单胺氧化酶B抑制剂都有不同程度的副作用［2］。本研究尝试用RNA干扰技术对单氨氧化酶B进行特异性的基因沉默，并尝试用这种低副作用的基因沉默技术替代传统的单胺氧化酶B抑制剂。现将使用RNA干扰技术对单胺氧化酶B进行基因表

3、达抑制的实验结果报告如下。1材料方法1.1siRNA设计与质粒构建以Genebank发表的MAOBmRNA序列(NM_000898)为模板，用Ambion公司网上提供的专用设计软件设计了两段siRNA序列(19nt)，将设计好的特异片段与pSilencerTM1.0-U6质粒所需的结构片段连接起来，最终合成了四条两两互补的单链DNA序列如下：第一对：以下命名为“MAOB-片段1”。5'-AATTAAAAAAAGGGCAAATCATACCCCTTTCTCTTGAAAAGGGGTATGATTTGCCCTGGCC-3'(61BP)5'-AGGGCA

4、AATCATACCCCTTTTCAAGAGAAAGGGGTATGATTTGCCCTTTTTTT-3'(53BP)第二对：以下命名为“MAOB-片段2”。5'-AATTAAAAAAATATGTGGACCTTGGAGGATCTCTTGAATCCTCCAAGGTCCACATATGGCC-3'(61BP)5'-ATATGTGGACCTTGGAGGATTCAAGAGATCCTCCAAGGTCCACATATTTTTTT-3'.按照文献中提供的siRNA序列［4］设计并合成了针对绿色荧光蛋白GFP的两条互补的单链DNA如下：(以下命名为“GFP-片段”)5

5、'-AATTAAAAAAGGCTACGTCCAGGAGCGCATCTCTTGAATGCGCTCCTGGACGTAGCCGGCC-3'(61bp)5'-GGCTACGTCCAGGAGCGCATTCAAGAGATGCGCTCCTGGACGTAGCCTTTTTT-3'(53bp).将上述单链DNA用退火缓冲液溶解(1μg/μL)，在PCR仪上退火成双链(90℃3min，37℃1h)，然后将2μL(8ng/μL)双链DNA用T4DNA链接酶和线性pSilencerTM1.0-U6质粒DNA(500ng)做链接反应(16℃过夜)。将连接好的纯化质粒转染

6、到JM109大肠杆菌中，挑取克隆并用酶切法进行初步筛选，然后经DNA测序确定所选出的阳性克隆确实含有所设计的片段。富集扩增后提取质粒(Genopureplasmidmidikit，Roche)，纯化定量备用。1.2细胞培养和质粒转染将HELA细胞在24孔板(1×104/孔)中用含10％血清的DMEM培养，用Lipofectamine2000(Invitrogen)按说明书将质粒DNA转入细胞中，48h后提取RNA。为了监控质粒的转染效率，设计了GFP质粒转染组作为阳性对照组。将细胞培养在铺有载玻片的培养皿中，转染U6-RNAi空载或GFP-R

7、NAi质粒和pIRES2-EGFP质粒，转染48h后用荧光显微镜观察绿色荧光，监测转染阳性率。同时平行进行MAOB-RNAi实验组的转染实验。实验组只转染U6-MAOB-RNAi质粒，并用其空载补齐即可。实验分组如下：GFP对照组A.不转染对照(control)；B.转染pIRES2-EGFP质粒对照(GFP-control)；C.以1∶1比例共转染pIRES2-EGFP质粒和U6空质粒的对照(RNAi-empty)；D.以1∶1比例共转染pIRES2-EGFP质粒和含"GFP片段"的U6质粒(GFP-RNAi+GFP-control)。实验

8、组分组A.不转染对照(control)；B.转染U6空质粒对照(RNAi-empty)；C.转染含MAOB-片段1的质粒(MAOB-1)；D.转染含"MAOB-片段