槐米固态发酵提高槲皮素含量的研究

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1、槐米固态发酵提高槲皮素含量的研究【关键词】槐米；芦丁；槲皮素；黑曲霉；微生物转　　Abstract：ObjectiveFlosSophoraeImmaturusentationprocessbyanAspergillusnigerstraintotransformrutinintoquercetin.MethodsTheconditionsofcultureandfermentationprocessizedbytheorthogonallayout.ResultsBymodulatingtheconditions,thebiomasscouldreach8.32g/Landt

2、hetransformationrateofrutincouldreach98%.Itmaturuscanbeincreasedbythemethodofmicrobialtransformation.　　Keymaturus;Rutin;Quercetin;Aspergillusniger;Microbialtransformation　　槐米（FlosSophoraeImmaturus）别名：白槐、柚花，为豆科植物槐SophorajaponicaL.的花蕾。具有凉血止血,清肝泻火的功能。多用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血等证的治疗［1］。其主要成分为黄酮醇类芸香苷—芦丁，此

3、外还含有鞣质、植物甾类、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等成分［2，3］。-3。　　1.1.2材料与试剂　　槐米，购于四川广松制药有限公司，自行打粉，粒度为20目。芦丁标准品，槲皮素标准品购于成都思科华有限责任公司；其它常用化学试剂均为市售分析纯。无机盐浓缩液：KH2PO420g，MgSO410g，（NH4）2SO410g，加热溶解，定容至100ml备用。　　1.1.3仪器HZQ-X100恒温恒湿培养箱（哈尔滨）；HZQ-C空气浴震荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；ShimadzuLC-10AT高效液相色谱仪(包括LC-10AD泵，7125RheODyne进样阀,SP

4、D-10A紫外检测器,CBM-10A色谱工作站,日本岛津公司)。　　1.2方法　　1.2.1菌种培养条件的确定通过单因素实验初步考察玉米糖化液浓度、酵母膏的加入量范围。再按照正交实验表L9(34)分别对酵母膏，10%的麸皮汁，芦丁，玉米糖化液的添加量进行优化。接种量0.5%，30℃，180r/min培养24h。　　1.2.2芦丁及槲皮素的薄层色谱（TLC）检测方法取发酵样1g，加入10ml80%乙醇50℃水浴5min；聚酰胺薄膜（10cm×10cm），展开剂为无水乙醇∶水（9∶1），3%三氯化铁酒精溶液显色，观察。发酵样品点样量为10μl，芦丁及槲皮素溶液点样量为5μl。　　1

5、.2.3芦丁与槲皮素的高效液相色谱法（HPLC）检测方法色谱柱：ColumnsC18（250mm×4.6mm×5μm）；柱温：25℃；流动相：甲醇－水（60﹕40）；磷酸调pH3.5；流速0.9ml/min；检测波长365nm；进样量：10μl。芦丁标准曲线的制作：精密称取芦丁1.00mg，置于1.5ml的EP管中，加乙醇/水（1/1）溶解，精确吸取20，40，60，80，100μl的对照品溶液到1.5ml的EP管中并用乙醇/水（1/1）溶液稀释至100μl，然后吸取20μl进行测定。以峰高(Y)对含量（X）作回归计算，结果表明，在0.2～1mg/ml范围内，芦丁有良好的线性关

6、系，回归方程为Y＝2197.3X－38.452，R=0.9998。槲皮素标准曲线的制作方法同上，以峰高(Y)对含量（X）作回归计算，结果表明，在0.2～1mg/ml范围内，槲皮素有良好的线性关系，回归方程为Y＝2378.5X+13.512，R=0.9996。　　1.2.4发酵条件的确立　　以槐米粉为培养基成分，配以适当的料水比，pH自然，121℃灭菌25min。将菌种HM－3以菌丝体形式接入发酵培养基中，混合均匀后于恒温恒湿培养箱中培养。采用正交实验方法，确定无机盐浓缩液加入量、料水比、培养温度、环境湿度等发酵条件。　　1.2.5发酵产物的鉴定　　采用HPLC法检测发酵前后的槐

7、米成分与芦丁、槲皮素标准品相比较，确定微生物转化的物质。　　2结果与讨论　　2.1菌种培养条件的优化通过添加不同浓度的玉米糖化液作为菌体生长的碳源，确定玉米糖化液最佳加入量，实验结果如图1。　　由图可知，玉米糖化液在浓度10%～20%时，菌体量呈递增趋势，说明糖化液在该浓度下适合微生物生长的需要；糖化液浓度在20%～100%时，菌体量呈递减趋势，这是由于培养基的糖浓度过高时产生了糖抑制作用，抑制了菌体的生长。因此将玉米糖化液的加入范围控制在20%左右。经正交实验得到优化后的种子培养基为：0.