椎间盘细胞的细胞学特性与表型表达研究进展

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1、椎间盘细胞的细胞学特性与表型表达研究进展【关键词】,,椎间盘椎间盘是一个独特复杂的连接性组织，在脊柱的承重中扮演着重要的角色。椎间盘退变在成人中的发生率很高，退变的主要机理是椎间盘细胞衰老、凋亡，并导致细胞外基质的成分和结构改变。近年来，国内外大量研究了椎间盘细胞的特性和表型表达，这对于椎间盘退变的治疗和组织工程研究意义重大。以下就椎间盘的细胞学与表型特点以及如何促进其表型的表达与维持进行阐述。　　1椎间盘细胞的细胞学与表型表达　　椎间盘系无血管组织，有两个明显的解剖区域：外周的纤维环和中央的髓核，其共同点为髓核和纤维环的细胞数量均较少，细胞外基质丰富〔1〕。椎

2、间盘的细胞有脊索细胞、类软骨细胞、成纤维细胞。脊索细胞存在于胚胎期的髓核内，出生后逐渐减少，正常人10岁以后消失。类软骨细胞存在于髓核及纤维环的内层，而纤维环的外层主要为成纤维细胞。　　11体外培养的椎间盘细胞的形态学　　体外培养的不同物种的椎间盘细胞形态相似。新分离出的细胞均呈圆形，初贴壁时呈短梭形或多角形，胞质向外伸突，然后突起逐渐伸长，达亚融合状态时呈漩涡状或火焰状的细胞团，10～15d融合。传代的细胞贴壁后又恢复到短梭形或多角形，但随传代次数的增多，突起逐渐变长向梭形演化，最终演化为长梭形，生长缓慢，融合时间明显延长，即出现老化现象。　　相邻的细胞可通过

3、桥粒紧密连接〔2〕，胞质内有高尔基体、粗面内质网和大量的核糖体，并可见散在分布的圆形囊泡，泡间由平行或垂直的细丝连接，泡内充满颗粒，并被证实是蛋白聚糖〔3〕。线粒体的缺乏和糖原的存在曾被报道〔3〕是体内髓核细胞的特性，因为椎间盘组织为无血管组织，细胞的代谢主要为无氧代谢，能量来源于糖酵解，而体外培养的细胞因处于有氧的环境中，可见较多的线粒体，糖原很少或消失。胞核圆形，核膜界限明显，可见核仁。随着细胞的老化，细胞内线粒体和核糖体的数量逐渐减少，粗面内质网的囊池逐渐扩张。　　12椎间盘细胞的表型特性　　椎间盘的细胞外基质主要为胶原和蛋白聚糖。自20世纪70年代末以来

4、，国内外学者就开始对椎间盘中的胶原类型和分布进行研究，但仍存在争论。一般认为，纤维环含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，髓核中主要为Ⅱ型胶原。其中，Ⅰ型胶原由成纤维样细胞表达，分布于纤维环的外层，耐受张力及应力；Ⅱ型胶原由脊索细胞和类软骨细胞表达，分布于纤维环内层和髓核，承受压力；Ⅲ型胶原含量很少，仅占总量的3％，分布于纤维环Ⅰ、Ⅱ型胶原移行区〔5〕。在退变的髓核中，Ⅱ型胶原减少，并可见Ⅰ型胶原；退变重者，则整个椎间盘被Ⅰ型胶原及部分Ⅲ型胶原取代，表现为明显的纤维化〔6〕。Nerlich等〔7〕在人退变髓核中检测到X型胶原，而X型胶原是有丝分裂期后的骺软骨的特异性标记，暗示X

5、型胶原的产生可能是细胞对不正常压力的反应，并可能在修复中起作用。相反，Gan等〔2〕报道兔髓核无X型胶原。这差异可能是物种特异性或兔髓核尚未退变。　　蛋白聚糖在椎间盘中主要以聚合蛋白聚糖的形式存在，髓核中含量较多。Alini等〔8〕报道每100mg正常牛的纤维环组织内蛋白聚糖的含量为06～08mg，而髓核内的含量为31~47mg，约为纤维环的5～6倍。Gan〔2〕指出兔的髓核细胞主要产生聚合蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，也可见CD44和少量的碱性磷酸酶，CD44是细胞表面的一种糖蛋白，可能在介导聚合蛋白聚糖的产生中发挥作用。　　2如何促进椎间盘细胞的表型表达与维持　　21

6、建立三维培养体系　　体内的椎间盘细胞处于三维环境中，周围是丰富的细胞外基质。体外培养的细胞，细胞间的相互作用及存在方式对表型的调节非常重要，细胞只有在三维培养体系内，才可以产生大量的细胞外基质，表达自然的表型。　　1992年，Maldonado〔9〕首先尝试用藻酸盐小珠体系培养椎间盘细胞，使细胞在藻酸盐凝胶中生长，以模仿体内细胞的自然生存状态，维持形态学和表型稳定性，因此曾被广泛的用于研究细胞的特性〔9〕和蛋白聚糖的产生、转化。但随后发现此体系有几大不足：（1）对于不同的实验和研究人员，小珠的质量和大小不一致，不利于研究结果的对比；（2）小珠内的细胞数量不易控制

7、，导致结果的多样性；（3）组织学研究时，细胞产生的基质和藻酸盐基质不易区分，需将小珠溶解后细胞单层平铺才能清楚地获得组织学特性〔10〕。也有学者应用琼脂糖凝胶培养体系，可使椎间盘细胞较好的维持表型稳定性，但具有与藻酸盐小珠体系相似的不足。　　离心管内细胞团聚集培养技术是较新的细胞培养方法，首先被用于培养骨髓基质细胞。2001年Joon等〔11〕将分离的椎间盘细胞低速离心，形成直径1mm的细胞聚集体，以小球形式培养，3d后外周形成致密的纤维囊膜，细胞以三维形式生长于囊膜内，类似于自然存在状态。与单层和藻酸盐小珠培养相比，此方法明显增加了蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成，并

8、具如下优点：操作简单，组