椎间盘细胞组织工程的研究进展

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1、椎间盘细胞组织工程的研究进展【关键词】外椎近年来体外椎间盘髓核各纤维环组织细胞培养技术的建立，特别是软骨组织工程研究的不断深入及自体椎间盘细胞移植修复髓核缺损动物实验的初步成功，为退变椎间盘的形态结构与生理功能的完全再生修复带来了希望。利用组织工程学修复退变的椎间盘是具有变革性意义的新的治疗探索。现就椎间盘组织工程学研究中的种子细胞、细胞支架、相关生长因子等方面的研究进展综述如下。1椎间盘组织工程的种子细胞来源种子细胞是组织工程研究中最基本的环节。椎间盘种子细胞应具有如下特点：(1)适合临床应用需要，来源广泛、取

2、材简便、创伤小；(2)在体外扩增达到所要求的细胞数量时能维持原有的表型；(3)适应性强，植入机体后具备较强的传代繁殖能力。1.1自体椎间盘细胞目前国内外进行自体椎间盘细胞的单层培养或三维培养的实验研究很多，技术方法较成熟，相关报道亦较多。2001年Sun等〔1〕报道利用体外培养绵羊腰椎间盘髓核细胞，通过组织工程技术获得具有一定形态结构和相似成分含量的腰椎间盘髓核组织。Gruber〔2〕研究发现单层培养基中纤维环细胞形态为扁平形和梭形，免疫组化显示少量Ⅰ、Ⅱ型胶原形成：在血小板衍生生长因子(PDGF)作用下单层培养

3、细胞有丝分裂能力较强。Sato等〔3〕研究结果表明，单层培养条件下内层纤维环细胞基质中糖胺聚糖含量高于外层。内层纤维环细胞呈多角形，有丰富的细胞外基质，而外层纤维环细胞呈纺锤形，细胞外基质稀少。Gancey等〔4〕将狗自体髓核细胞体外培养，通过经皮穿刺途径重新植入标记后的同一实验对象椎间盘内，3、6、9、12个月后进行MRI、X线和组织学评价，亦发现自体髓核细胞植入有助于减缓椎间盘退变。Mizuno等〔5〕从羊腰椎间盘获取纤维环及髓核，分别进行分离，消化，细胞培养3周，纤维环支架通过聚乙醇酸和聚乳酸构建，髓核细胞

4、与2％的藻酸盐液混合后，注入到纤维环的中央，将复合体移植到裸鼠皮下，分别在4、8、12周时采集细胞进行胶原定型及蛋白多糖、羟基脯氨酸和DNA分析，结果显示，在人体标本及组织学方面，组织工程化椎间盘与正常椎间盘十分相似，并在12周时仍然类同于正常椎间盘组织，同时组织工程化椎间盘纤维环富含Ⅰ型胶原，髓核富含Ⅱ型胶原，亦与正常椎间盘组织相似。1.2同种异体及异种椎间盘细胞Nomura等〔6〕植入同种异体完整的兔髓核或有活性的髓核细胞，16周后的结果显示，接受完整髓核的椎间盘退变最轻，未治疗的对照组退变最重，各组均无免疫

5、排斥反应出现。提示虽效果不同，但同种异体髓核移植及单纯细胞移植均可抑制椎间盘退变。Kusior等〔7〕从小牛的髓核组织中分离细胞，单层培养约2周后分别接种在3种不同的聚合物(聚乙醇酸、藻酸钙、聚醚)上，而后植入裸鼠皮下，1、3、5、10周后获取标本，与对照组相比，聚合物上长出大量的类髓核组织。Sato等〔8〕将从日本兔椎间盘中分离出的纤维环细胞用PKH-26荧光染色标记后种植于蜂窝状胶原基质支架内，培养1周后移植于髓核被激光汽化的白兔的椎间盘内，分别于术后2、4、8、12周通过X线片观察椎间盘高度丢失情况并取椎间

6、盘标本，通过标本连续冰冻切片评估荧光染色后的髓核细胞的增殖能力，同时将标本番红染色后进行组织学评定，研究发现同种异体移植细胞能在受体的椎间盘内存活，并具有透明软骨样的细胞增殖能力，能够有效预防椎间盘高度的丢失。1.3间充质干细胞(MSCs)MSCs是具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能的原始细胞，具体向何方向分化是由周围微环境调控的。在培养基中加入一定的诱导剂可以诱导MSCs向一定方向分化。MSCs可通过患者自体骨髓穿刺获取，操作容易，并发症少，可避免产生免疫排斥反应。来于自体，无需配型，无抗原性，是

7、组织工程中重要的种子细胞之一〔8〕。来源于骨髓、脂肪组织的间充质干细胞可通过体外培养大量扩增，并能在成软骨或成纤维组织培养条件下诱导分化为成软骨细胞或成纤维细胞。Zuk等〔10〕从人体抽吸的脂肪组织中分离培养出成纤维样细胞，此细胞能在体外稳定扩增。使用免疫荧光和流式细胞仪分析发现，这些细胞大部分来源于中胚层或间充质，在一定条件下，可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化。Sakai等〔11〕将兔自体间充质干细胞植入胶原凝胶支架，培养后再植入兔髓核中，结果显示其可减缓椎间盘退变，增强了MSCs实际应用于椎间

8、盘退变治疗的可能性。鞠小东等〔12〕取2周龄Leura等〔13〕和1998年ShinmEi等〔14〕进行了椎间盘细胞的单层培养。观察影响细胞培养的因素，检测蛋白多糖、胶原和DNA的合成。1999年刘勇等〔15〕也成功地进行了胎儿椎间盘细胞的单层培养。目前，国内外进行椎间盘细胞单层培养的实验研究较多，技术方法已经成熟。2.2椎间盘细胞的三维培养2.2.1静止性三维细胞培养由