中国人rh部分d表型的分子机理研究

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1、中国人Rh部分D表型的分子机理研究作者：吴俊杰，洪小珍，许先国，何吉，傅启华，严力行【摘要】为了研究部分D表型的分子机理，用间接抗人球蛋白方法(IAT)筛选弱表达的D变异体，PCR-SSP（polymerasechainreaction-sequencesepecificprimer）方法扩增RHD基因特异的外显子及其侧翼序列，用PCR产物直接序列分析测定核苷酸的变异。结果表明：从22例弱D中检测到10例部分D表型，其中DVa（Kou.）、DVa（Hus.）和DVa-like（YH.）各1例，DVItypeⅢ表型7例。结论：10例部分D表型的分子机理得到

2、明确，其中DVa（Kou.）、DVa-like（YH.）表型为国内首次报道。【关键词】Rh血型　　MolecularBasisofPartialDPhenotypesinChinese　　AbstractToinvestigatethemolecularbasisofpartialDphenotypesinChinese，Dvariantsanglobulintest(IAT)method，thepolymerasechainreaction-sequencspecificprimer(PCR-SSP)methodployedtoamplifyRHDsp

3、ecificexonsandthEirflankingregions.TheamplificationproductsinethemolecularbasisofDvariants.Theresultssho22casesofolecularbasisoftencasesofpartialDphenotypeed，includingDVa（Kou.）andDVa-like（YH.）phenotypesreportedfirstlyinChinesepopulation.　　Keyinion公司的NAVACLOM混合单克隆抗D试剂（人单克隆IgM抗D，D1

4、75-2细胞株；人单克隆IgG抗D，D4151E4细胞株）。根据试剂说明，盐水实验Rh阴性的Rh血型用IAT方法进一步确认。如果IAT实验阳性，并且直接抗人球蛋白实验阴性，则鉴定为弱D表型或者部分D表型；如果IAT实验阴性，则鉴定为Rh阴性。抗人球蛋白试剂用美国Immuco公司的兔源抗IgG。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为加拿大Titus公司的单克隆抗体。　　基因组DNA提取　　采用PuregeneDNA纯化试剂盒(Gentra，Minneapolis，USA)，从枸橼酸钠抗凝的外周血中制备基因组DNA，严格按试剂说明书操作。　

5、　D杂合性检测和单倍体型推测　　根据Perco等的方法［2］，用特异性引物u1-s和rnb31PCR检测Rhesushybridbox。如果可以扩增得到2778bp的特异性片段，表明存在Rhesushybridbox，有RHD基因的缺失；反之，则不存在Rhesushybridbox，没有RHD基因的缺失。最大可能的单倍体型根据RHCE基因的C/c和E/e等位基因和RHD基因是顺式共遗传，并且RHD基因缺失的单倍体型按cde推算。　　PCR-SSP　　参照gCl2终浓度1.5mmol/L（TaKaRa公司，中国大连），dNTP终浓度200μmol/L(Pr

6、omega公司，美国)，Taq酶1U（TaKaRa公司）。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒、64℃(外显子1、2、3、7)/67℃(外显子4、6、8、9、10)/60℃(外显子5)退火30秒和72℃延伸1分钟，循环35次，最后72℃延伸10分钟。PCR扩增仪为PE2700（AppliedBiosystems公司，美国）。Table1.PrimersusedinspecificamplificationandsequencingofRHDexonsandthEIrflankingregions（略）　　PCR产物直接测序　　PCR扩

7、增产物用PCR产物纯化试剂盒(QiagenGmbH，德国)纯化后，直接用于序列分析反应。序列分析反应采用“BigDyeTMTerminatorCycleSequencingKit”试剂盒，DNA聚合酶采用AmpliTaqDNAPolymerase（AppliedBiosystems公司，美国），最后用ABI377测序仪(AppliedBiosystems公司，美国)作序列分析。　　结果　　D杂合性检测　　10例部分D都可以扩增得到2778bp的特异性片段，表明存在Rhesushybridbox，有RHD基因的缺失。　　10例部分D的分子鉴定　　通过对RH

8、D基因特异的外显子及两翼序列的扩增和序列分析，我们共检测到4类部分D的等位基因（