蒙古白马褪色表型形成机理分子遗传学地研究

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1、本研究由以下项目资助农业部公益性行业科研专项（项目编号：201003075）内蒙古科技厅重大科技支撑项目（项目编号：20091404）内蒙古农业大学创新团队支持计划（项目编号：NDTD2010-12）摘要马毛色基因研究是毛色遗传学领域的重要研究内容之一，被毛颜色不仅是品种和个体鉴别的重要依据，也可以作为诊断某些疾病的途径，而且也是制定育种方案时必须考虑的重要性状之一。马毛色研究不仅具有实际应用意义，更具有特殊的经济价值和文化价值。因此，马毛色研究成为马遗传学研究领域的重要内容，尤其是马褪色被毛表型

2、的研究已成为当今国际马毛色遗传学研究领域的重要内容，试图揭示导致马被毛褪色的真正机理。蒙古马是世界上最古老的马品种之一，不仅有骝、栗、黑等基础毛色，而且还有斑点、灰褐及褪色表型等稀有毛色。其毛色种类的多样，是研究马毛色遗传的最佳模型。具有被毛颜色完全褪色表型的马群非常少见，只是偶尔在有些马种中出现，但在内蒙古自治区锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗生存着较大数量的被毛褪色表型个体，被称为蒙古白马，将其又可分为两种类型，即具有显性白毛色特征的个体和灰毛色个体。随着马全基因组序列的公布，控制马不同性状和表型的基因

3、逐渐被揭晓。据有关资料显示，马的褪色毛表型被几个基因所控制，然而存在着较大的种间差异。基因在序列上的突变可导致机体出现不同的性状，但有时即便基因序列完全相同，也有着不同的表现型。随着后基因组时代的到来，科学家们提出了许多新的理念和实验方法，其中因表观遗传学中的甲基化修饰可以解释基因序列相同而表型不同的生物学现象从而成为了当今分子生物学领域的研究热点。本研究将蒙古白马做为研究对象，首先选择MC1R、ASIP、MATP、SB1和STX-17等五个毛色候选基因的限制性多态位点对选择的个体进行分型，对其毛

4、色作出分子生物学鉴定，确定是否试验选择个体的毛色表型与已公布的毛色基因多态位点研究结果一致；其次采用实时荧光定量PCR方法以β-actin基因为管家基因测定蒙古白马皮肤中MC1R、ASIP、KIT、STX-17、MATP和EDNRB六个毛色候选基因的表达量；同时采用高通量测序技术对MC1R、ASIP、KIT、STX-17、MATP及EDNRB六个基因的外显子区及部分非编码区进行了多态性研究；采用蛋白免疫印迹技术对蒙古白马KIT基因在皮肤中的表达进行了进一步验证；最后对KIT基因的启动子区进行了甲基

5、化修饰差异分析研究；经上述研究，为蒙古白马褪色表型的形成机理提供了重要的理论依据及线索，得到的主要研究结果如下：1、将作为该试验研究对象的17匹蒙古马（有色毛和褪色毛）进行分子生物学毛色鉴定，其结果显示：选择的个体毛色表型与其毛色候选基因的限制性多态位点存在一定的相关性，可以通过检测MC1R、ASIP、SB1、STX-17及MATP的基因型来初步判断其毛色类型，并提示不能只考虑单独的某个基因型，而需要对几个基因型进行综合分析并且参考毛色表型才能对其毛色做出最后的判定。2、对17匹蒙古马（有色毛和褪

6、色毛）皮肤中相关毛色候选基因的表达进行相对定量研究，其结果显示：毛色候选基因MC1R、ASIP、KIT、STX-17、MATP及EDNRB基因均在骝色毛个体中的表达量高于褪色毛表型的个体，提示蒙古白马褪色被毛及皮肤表型的出现与毛色候选基因在皮肤中的表达量存在一定的相关性，但并非是由于某个基因的表达量的差异所致，是几个基因共同作用的结果，但其相互间的作用机理还需进一步研究。3、对三种不同毛色表型的MC1R、ASTP、KIT、STX-17、MATP及EDNRB基因的外显子区和部分非编码区进行扩增后比较

7、分析发现：在具有显性白毛色表型的蒙古白马中MATP基因的5’调控区存在一68bp的缺失和TG→GT碱基间的颠换，在第一外显子33位点处发现一CCC(P)→CAC(H)的错义突变，并在第二外显子中发现23位点处发现一G碱基的缺失，在3’调控区还发现存在一A→T间的替换。但在其他毛色候选基因序列中未发现典型的多态位点。4、对有色毛和褪色毛个体皮肤中KIT基因所表达的蛋白进行定量分析发现：蒙古白马褪色表型个体皮肤中KIT基因所表达的蛋白含量明显低于有色毛个体，通过灰度分析发现灰毛色个体该蛋白的含量稍高于

8、具有显性白毛色表型的个体。5、通过使用表观遗传学分析软件对以上六个基因的5’调控区进行分析发现，在KIT基因存在一593bp大小的CpG岛，并采用BSP直接测序法对骝色毛及褪色毛表型蒙古马皮肤组织基因组DNA中KIT基因CpG岛的甲基化模式进行测定比较，结果显示在有色毛和褪色毛表型蒙古马KIT基因中未发现甲基化修饰差异。关键词：蒙古白马；毛色；多态性；差异表达；调控TheMolecularGeneticalInvestigationonFormationMechanismofDep