重症监护病房老年患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因分析

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1、重症监护病房老年患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因分析作者：周俊英付有荣郭清莲【摘要】目的为了解重症监护病房(ICU)老年患者感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分子流行病学特点、菌株的变异情况及耐药性。方法采用KB法药敏实验、SCCmec多重PCR技术和ERICPCR技术对13株呼吸道感染老年患者MRSA进行分析，并运用NTSYSPC2.0对ERICPCR扩增产物结果进行聚类分析。结果13株MRSA中，12株鉴定为SCCmecⅠA型，1株鉴定为SCCmecⅡ型。13株MRSA的DNA同源性在44%到

2、88%之间，同源性在69%以上可分为3类。结论ICU老年患者感染的MRSA主要流行型为SCCmecIA型，但是并不存在聚集性人群感染发生。【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；ERICPCR；多重PCR；基因分型1961年英国报道了世界上第1株MRSA,其后大量不同克隆的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株出现并在全球播散〔1〕。MRSA大多表现为多重耐药,不仅对β内酰胺类抗菌药耐药,还常对喹诺酮类、氨基苷类和大环内酯类等抗菌药物耐药。万古霉素被认为是治疗MRSA感染的最后一道防线，但近几年又发现了对万古霉素耐

3、药的MRSA〔2〕。这给临床治疗MRSA感染带来了很大困难。因此,对MRSA耐药性及流行病学研究对于正确治疗其引起的感染、防止其播散、及时控制其引起的暴发流行有重要意义。为此,我们对重症监护病房(ICU)老年住院患者分离的13株MRSA的分子流行病学特征及耐药性进行了研究，为临床防治MRSA提供参考依据。　　1材料与方法　　1.1菌株来源　　13株金黄色葡萄球菌均为2007年3月本院ICU呼吸感染的60岁以上老年患者。　　1.2药敏试验　　16种药敏纸片购于北京天坛生物制品生物药检定所，采用KB法，结果判读采用N

4、CCLS2004年标准。　　1.3MRSA检测　　用苯唑西林(每片30μg)、头孢西丁(每片30μg)对13株金黄色葡萄球菌做药敏试验，当头孢西丁抑菌圈直径≤19mm时判断为苯唑西林耐药，确定为MRSA；当抑菌圈直径≥20mm判断为苯唑西林敏感，确定为MSSA。并用标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213作质控菌株，质控范围为23～29mm。　　1.4引物序列　　均由北京奥科生物有限公司合成，根据其合成参数均稀释为100mmol/L浓度，其序列及产物大小见表1。表1引物序列及产物大小（略）　　1.5DNA模板制备　

5、　按实验室常规的酚/氯仿法提取。　　1.6PCR扩增条件与反应参数　　总反应体系为20μl，其中含DNA模板2μl、MgCl225mmol/L为1.2μl引物ERIC1或ERIC2各为2μl、dNTP(10mmol/L)1μl、10×PCR缓冲液2μl，DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl(DNA聚合酶购自上海生工公司，dNTP购自Promega公司)，无菌水9.3μl，以TE液代模板DNA作空白对照。温度设置：94℃预变性5min；94℃变性1min、52℃退火1min、72℃延4min共30个循环，最后72℃

6、延伸8min结束反应。　　1.7SCCmec多重PCR　　总反应体系为20μl，其中含DNA模板为2μl、MgCl225mmol/L为1.2μl，dNTP(10mmol/L)1μl、10×PCR缓冲液2μl、DNA聚合酶(5U/μl)为0.5μl(DNA聚合酶购自上海生工公司，dNTP购自Promega公司)，14种引物各为0.5μl、无菌水6.3μl，以TE液代模板DNA作空白对照。温度设置：94℃预变性4min；94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延1min共30个循环，最后72℃延伸8min结束反应。　

7、　1.8扩增产物凝胶电泳分析　　取5μlPCR产物，混合1μl加样缓冲液，点样在1.5%琼脂糖凝胶，电泳液为TBE缓冲液(0.1mol/LTrisHCl、0.1mol/L硼酸，0.002mol/LEDTA，pH8.0)，电压为8V/cm，溴芬兰至胶前端约1.5～2cm处停止电泳。电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含溴化乙锭（EB）的染液中，染色15min后用净水冲洗15min，然后凝胶成像仪紫外灯下观察并拍照记录结果。　　2结果　　2.1纸片扩散法药敏试验结果　　13株MRSA对加替沙星、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、阿

8、奇霉素、左氧氟沙星、克林霉素、苯唑西林和青霉素耐药率分别为83.3%、82.8%、80.6%、83.3%、88.2%、77.8%、88.3%、84.5%和100%。较敏感的四环素为90.4%，未发现耐替考拉宁和万古霉素的菌株。　　2.2多重PCR扩增结果PCR扩增结果见图1。　　从左到右泳道依次为13株MRSA，M为分子量标准　　2.3EiRCPCR扩增结