μ型阿片受体和催产素受体二聚化的研究

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1、μ型阿片受体和催产素受体二聚化的研究【关键词】受体阿片样μ受体催产素受体G蛋白耦联［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheexistanceofheterodimersofμopioidreceptor(MOR)andoxytocinreceptor(OTR).MethodsTheimmunoprecipitation(IP)andfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)erizationofMORandOTRintheChinesehamsterovarycells(CHO)cotransf

2、ectedbyMORandOTRplasmidandintheratbraintissue.ResultsThebandsofMORandOTRersofMORandOTRexistinthecotransfectedCHOcellsandbraintissues.［KEYOR）和催产素受体（OTR）间是否可以形成异源性的受体二聚体，以期为进一步探讨吗啡抑制催产素合成与释放的机制提供分子学基础。1材料与方法1.1材料实验所需质粒均由第二军医大学神经生物学教研室提供。MOR和OTR抗体由第二军医大学神经生物学教研室制备。脂质转染购自Qiagen公司。荧光抗体购自Roc

3、kland公司。蛋白A胶联珠购自Pharmacia公司。大鼠购自中国科学院动物中心。1.2方法1.2.1细胞培养中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养以含体积分数0.10胎牛血清的PRMI1640为培养基，在37℃、含体积分数0.05二氧化碳的培养箱中培养。1.2.2转染CHO细胞均匀分布在瓶底80%的面积时，用pcDNA3.1MOR、pcDNA3.1OTR质粒单转或双转CHO（MOROTRCHO）细胞，具体步骤按照脂质转染试剂操作说明进行。1.2.3免疫细胞荧光和IP检测具体步骤参照分子克隆。1.2.4脑组织裂解脑组织裂解方法参考MIKAELA等[6]的方法，大鼠

4、脑组织在NP40组织裂解液中行匀浆处理，低温超速离心30min，取上清存于-70℃冰箱待用。1.2.5FRETCHO细胞接种于无菌玻片上，分5组进行质粒转染：共转pECFPN1和pEYFPN1组（阴性对照组），转染pECFPYFP组（阳性对照组），共转pECFPN1MOR和pEYFPN1OTR组（实验组），单转pECFPN1MOR组，单转pEYFPN1OTR组。荧光质粒瞬时转染48h后将玻片置于三通道FRET荧光显微镜下,应用成像软件Imageproplusversion5.0.1拍摄图像。参照DAVID的方法对FRET图像进行分析。2结果2.1MOR和

5、OTR异源二聚体的IP检测野生型CHO细胞或MOROTRCHO细胞以MOR抗体为IP抗体,OTR抗体做免疫印迹（IB）检测，结果显示,野生型CHO细胞泳道中无条带出现，MOROTRCHO细胞泳道上有相对分子质量约为54000的蛋白条带（图1a）。将IP抗体和IB抗体互换后重复上述实验，结果显示，野生型CHO细胞泳道中无条带，而MOROTRCHO细胞泳道上有相对分子质量67000左右的蛋白条带（图1b）。2.2大鼠脑组织中MOR和OTR的受体二聚体大鼠脑组织裂解液，以MOR抗体和OTR抗体交替作为IP抗体和IB抗体，结果与MOROTRCHO细胞的免疫共

6、沉淀结果一致（图1）。图1MOROTRCHO细胞和脑组织裂解液免疫共沉淀图1a①MOROTRCHO细胞，②脑组织，③野生型CHO细胞;IP抗体:MOR抗体(1∶1000),IB抗体:OTR抗体(1∶500)，二抗：1∶10000。图1b①MOROTRCHO细胞，②野生型CHO细胞，③脑组织;IP抗体:OTR抗体(1∶1000),IB抗体:MOR抗体(1∶1000),二抗：1∶100002.3MOR和OTR异源二聚体的FRET检测阴性对照组CHO细胞FR值为1.43±0.12，阳性对照组为2.21±0.18，实验组为2.01±0.17。实验组FR均值明显高

7、于阴性对照组（P<0.05），而实验组与阳性对照组间差异无显著性（P>0.05）。3讨论GPCRs受体多聚化正在受到越来越多的重视，目前发现GPCRs三个主要家族均有能形成多聚体的受体。本文证实了同属于GPCRs受体A族的MOR和OTR在体外培养细胞和大鼠脑组织内均可形成异源性二聚体。在IP检测MOR和OTR共转染CHO细胞及脑组织裂解液时，MOR蛋白均显示为一条相对分子质量67000左右的条带，而根据NCBI基因库中的MOR核酸序列计算，MOR蛋白相对分子质量为45000。THOMPSON等[7]在1993年报道MOR序列中有5个与氮相连的糖基化位