g蛋白联受体激酶介导的δ阿片受体磷酸化及脱敏的研究

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1、上海医科大学博士学位论文G蛋白联受体激酶介导的δ阿片受体磷酸化及脱敏的研究姓名：郭骏申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：马兰2000.5.1中文摘要内阿片肽作为一类重要的神经递质对神经、感觉、运动、免疫等系统的功能具有重要调节作用，尤其对痛的调节作用最为突出。f而阿片类药物以强大的镇痛作用、情绪效应和成瘾性成为一类极其重要的药物。经典药理学实验和最近的基因敲除实验都证实：内阿片肽的功能、阿片类药物的镇痛作用及其长期使用所导致的药物耐受、成瘾都是由体内的阿片受体所介导。阿片受体属G蛋白偶联受体(GPCR)，分为¨、8、K三种亚型。阿片受体与激动剂结合后激活Gi蛋白，使G

2、蛋白的Bv亚基与0【亚基解离。13Y亚基与o【亚基分别介导了胞内多条信号通路的激活，如腺苷酸环化酶活性的抑制、G蛋白偶联受体激酶(GRK)、PKC和MAPK的激活等。在激动剂的长期作用下阿片受体介导的信号会逐渐减弱，即产生脱敏。阿片受体的脱敏被认为是机体对阿片类药物产生耐受}生和成瘾性的分子机制之一。目前，G蛋白偶联受体的脱敏研究工作主要是f奠132．肾上腺素受体和视紫红质受体作为模型的。研究认为：G蛋白偶联受体的磷酸化(包括同源磷酸化和异源磷酸化)、调节蛋白13-arrestin与磷酸化的受体的结合而导致的受体的内吞以及受体的下调等是GPCR脱敏的主要机制。在GPCR的同源

3、脱敏中，GRK催化的受体磷酸化被认为是受体脱敏的一个关键环节。阿片受体同源磷酸化和异源磷酸化都已被许多实验室所报道。其中，催化阿片受体发生异源磷酸化的蛋白激酶有PKC和酪氨酸激酶等。但在激动剂诱导的阿片受体同源磷酸化研究中，大量实验数据提示GRK起关键作用。然而，激动剂诱导的阿片受体磷酸化的确切位点、GRK催化受体发生磷酸化的位点，目前仍未见报道。我们实验室最近的研究证实：6阿片受体(DOR)的内吞、DOR与13-arrestin的相互作用需要DOR的C末端区，并且，激动剂依赖的DOR的磷酸化位点位于其C末端区。小鼠8阿片受体的C末端区含有四个苏氨酸残基和两个丝氨酸残基，它们

4、是潜在的磷酸化位点。J为了研究激动剂诱导下DOR的磷酸化具体发生于哪一个位点，我们首先构建了C末端区缺失六个丝／苏氨酸残基及三个丝／苏氨酸残基的DOR突变体A31和A15。在转染HEK293细胞48小时后，放射配体结合实验、免疫沉淀实验以及免疫荧光实验的结果都显示，受体C末端区的缺失不影响配体与受体的结合及受体的表达。／f35S]GTPl,S结合分析方法及cAMP放射免疫分析方法对受体介导的功能的检测结果发现，DOR的c末端区的缺失不影响激动剂诱导的G蛋白的活化和细胞内c舳水平的下调。以上结果表明：C末端区的缺失不影响受体的表达及其与G蛋白的偶联。P～，在用A31、A15或野

5、生型受体转染HEK293细胞48小时后，我们采用32Pi标记细胞，在DOR特异激动剂DPDPE刺激后，通过免疫沉淀富集受体，SDS．PAGE分离受体，最后通过磷屏扫描仪或者x光片放射自显影，观察受体的磷酸化水平。／结果发现：野生型受体发生磷酸化，△31不发生磷酸化，而A15虽然缺失T358、T361和$363但仍含有$344、T352、T353三个潜在磷酸化位点，却不发生磷酸化。这表明DOR的c末端的含有T358、T361、$363等三个潜在磷酸化位点的最后15个氨基酸残基是激动剂诱导的DOR发生磷酸化所必需的。进一步研究发现，T358、T361、$363都被甘氨酸或丙氨酸取

6、代的6阿片受体M3也不发生磷酸化，T358、T361、$363等分别被甘氨酸或丙氨酸取代的受体，DPDPE刺激的磷酸化与野生型受体相比下降了80．100％，而在同样条件下，$344、T352、T353被甘氨酸或丙氨酸取代对受体磷酸化没有影响。证明：激动剂诱导的DOR的磷酸化发生于DOR的c末端区的最后三个丝／苏氨酸残基之中，T358、T361和$363这三个氨基酸残基对激动剂诱导的DOR的磷酸化都有重要贡献．，，许多数据提示：激动剂诱导的阿片受体磷酸化是由GRK介导的，而PKA、PKC都不参与。我们的研究发现，GRK2的过量表达，使野生型受体的磷酸化增加了150％，但却不能使

7、突变体△31、△15及M3发生磷酸化。陋一结果表明：GRK2催化DOR发生磷酸化的位点位于T358、T361和$363这最后三个丝／苏氨基酸残基中，提示GRK是激动剂诱导的DOR磷酸化过程中最主要的蛋白激酶。T358、T361、$363在GRK介导的DOR磷酸化过程中，可通过两种方式发挥作用，一种方式是其本身即为磷酸基团的接受者(phosphateacceptor)，另一种方式是其本身虽不是磷酸基团的接受者，但却可参与受体与GRK间的相互作用。为了尽量减弱以甘氨酸或者丙氨酸取代可能对受体与GRKffn_