食欲素1型受体和胆囊收缩素1型受体异源二聚化的实验研究

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3、的研巧工作做出重要贡献的个人和集体，均己在。文中作Ｗ者明签确的方式注明。本声明的法律结果将完全由本人承担。曲名阜：师ｉ范祭大学研究生学位论文使日用期授；权书女（根据学位论文类型相应地在＂□＂划＂Ｖ＂）宽《食欲素１型受体巧胆巧收缩素１型受体异源二聚化的变驗研导下》系完本成人在曲阜师范大学攻读博±〇／硕±□学位期间，在导师指大学所有的博±口／硕±□学位论文。本论文的研巧成果归曲阜师范，本论文的研究内容不得其他单位的名义发表。本人完全了解曲阜师范大学关于保存、使用学位论文的

4、规定，同意学校保留并本向有人授关权部口送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅。公开发表曲阜论文师范大学，可采用影印或其他复制手段保存论文，可作者签的全部或部分内容。导师签名名：１翁日期化：＇冷．务—．ｒ＂日期：ｙ＊摘要摘要食欲素1型受体（Orexin1receptor，OX1R）主要分布在哺乳动物的中枢神经系统，以正反馈的方式调控机体的摄食量，达到增进食欲的作用。胆囊收缩素1型受体（Cholecystokinin1receptor，CCK1R）主要分布在哺乳动物的中枢

5、神经系统、消化系统。以负反馈的方式调节机体的摄食行为。OX1R和CCK1R均属于G蛋白偶联受体超家族成员，关于OX1R和CCK1R分别在食欲调节方面的研究较多，但对于OX1R和CCK1R异源二聚化的研究尚未有报道。本实验首先从研究OX1R和CCK1R能否形成异源二聚体研究，然后分析异源二聚体对下游信号转导的影响，阐述OX1R和CCK1R的二聚化的形成对食欲调节作用的分子机制，从而为临床治疗食欲调节相关的疾病（如肥胖，糖尿病等）提供实验理论和实验依据。利用分子克隆的原理构建CCK1R-EGFP、CCK1R-Rl

6、uc、CCK1R-Myc、OX1R-YFP、CCK1R-CFP五种真核重组质粒。采用免疫荧光染色技术制备瞬时转染共表达OX1R-EGFP和CCK1R-Myc的HEK293T细胞玻片，并在激光共聚焦扫描显微镜下观察，确定OX1R和CCK1R在细胞中表达的位置。本实验利用生物共振能量转移技术(BRET)、荧光共振能量转移技术(FRET)以及免疫共沉淀(CO-IP)三种方法分别在时间、空间和蛋白水平检测二者的异源二聚化。通过双荧光素酶法检测在配体OrexinA和CCK(26-33)作用下单独表达OX1R、CCK1R

7、和共同表达OX1R/CCK1R两种受体的HEK293T细胞内的报告基因NFAT-激活T细胞的细胞核因子、SRE-血清反应元件、SRF-血清反应因子、CRE-cAMP反应元件的表达。实验显示，CCK1R-EGFP、CCK1R-Rluc、CCK1R-Myc、OX1R-YFP、CCK1R-CFP五种重组整合质粒构建成功，在激光共聚焦扫描显微镜的观察表明，OX1R和CCK1R在细胞膜上表达，在空间上奠定了二者形成异源二聚体的物质基础。BRET、FRET和CO-IP三种方法从三个不同的角度证实了二者形成结构组成型的异源

8、二聚体。同时，在给予相应的配体作用后异源二聚体的相互作用显著增强。将HEK293T-OX1R、HEK293T-CCK1R和HEK293T-OX1R/CCK1R稳转细胞系分别瞬时转染SRE-luc、SRF-luc、NFAT-luc和CRE-luc，37℃，5%CO2恒温培养48h后给予相应配体刺激后检测SRF、NFAT、SRE或CRE的表达。结果表明，与单独转染CCK1R或OX1R的HEK293T细胞