smad蛋白在bmp2诱导成骨分化过程中的作用

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1、Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用【摘要】目的研究Smad蛋白在骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导成骨分化过程中作用，探讨Smad蛋白在成骨分化期间信号传导的机制。方法将取自MDX大鼠颅盖骨组织分离获得成骨细胞进行培养，培养的成骨细胞分组，加入不同浓度的BMP2或BMP2与Trx2SARA混合物后，用反义PCR和P2或BMP2和Trx2SARA，取不同时间点处死动物，制备组织切片，用SO染色进行组织学观察。结果BMP2处理的成骨细胞碱性磷酸酶增加，降钙素mRNA增加，Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖

2、性增加。Trx2SARA处理组出现碱性磷酸酶和降钙素mRNA下调。体内实验组织切片SO染色显示，BMP2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成，而Trx2SARA处理组很少向软骨源细胞分化。结论Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。【关键词】Smad蛋白质类骨形态发生蛋白质类成骨分化［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheeffectofSmadproteinonosteogenesisinducedbybonemorphogeicprotein2(

3、BMP2)signal.MethodsPrimarycalvarialosteoblastsent.ReversetranscriptionPCR(RTPCR)andP2signaling.［KEYP2)是转化生长因子β（TGFβ）家族成员之一，可促进多种细胞的生长、分化和抑制细胞的凋亡。在生长发育过程中，BMP2是调节成骨的重要生长因子。然而，关于BMP2在诱导成骨分化方面的作用机制目前尚不清楚。为此，本研究旨在分析Smad蛋白在BMP2诱导新骨形成过程中的作用，探讨Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程

4、中的作用机制。1材料和方法1.1实验动物选择雄性MDX小鼠12只，2～3周龄，体质量27～35g。1.2细胞培养取MDX小鼠的颅盖骨，通过一系列酶消化方法分离获得成骨细胞[1]，进行细胞培养，在培养板上细胞达到80%的融合后分组，各组分别加入500、200、0mg/L的BMP2作用24h，收获细胞进行蛋白和RNA分析。为观察BMP2诱导长期的成骨细胞分化，将培养的成骨细胞又分为3组：1组加入浓度为500mg/L的BMP2，2组加入BMP2和Trx2SARA，3组不加入任何物质做为对照。5d后对细胞进行蛋白和RNA分

5、析。1.3反义PCR(RTPCR)和P2注射组（Ⅰ组）和BMP2与Trx2SARA注射组（Ⅱ组）。Ⅰ组和Ⅱ组于海绵内装填50μg的BMP2，海绵冻干放入肌袋内，用50可吸收线间断缝合肌肉和皮肤组织。在BMP2植入前2d，Ⅱ组动物注射10μg/L的Trx2SARA。苏醒后笼内放养，正常进食、饮水。在手术后2周处死动物。标本用40g/L的多聚甲醛固定3d，4℃下在200g/LEDTA(pH7.4)中脱钙5d。脱钙后，标本用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，10μm厚切片，置于TESPA处理的载玻片上。切片脱蜡，通过梯度乙醇浸

6、入水中重新水化，随后进行SO染色行组织学观察。2结果应用不同剂量的BMP2处理24h，BMP2处理的成骨细胞主要向成骨细胞分化，表现为碱性磷酸酶（ALP）和降钙素mRNA增加，以及成骨细胞分化的基因表达增加(图1)。P2和Trx2SARA处理的成骨细胞，ALP和降钙素mRNA水平下降（图3、4）。组织切片SO染色显示，术后2周BMP2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞的软骨构成(图5)。Trx2SARA处理组很少向软骨源性分化，很少观察到肥厚软骨细胞(图6)。Smad蛋白家族是近年发现的新的细胞内信

7、号传导蛋白，直接参与骨形态发生蛋白等多个成员的信号转导[5～7]。在胚胎发生、个体形成、非对称器官的形成过程中具有重要作用。在哺乳动物目前已经分离获得8种类型的Smad蛋白，根据其结构和功能它们又被分为3个亚型：受体调节的Smads蛋白（RSmad）、共同介导的Smads蛋白（coSmad）和抑制性Smads蛋白（antiSmad）[8]。来自BMP家族成员的信号作用于Ⅱ和Ⅰ型丝氨酸苏氨酸激酶受体,而后通过细胞内的多种蛋白传导其信号。活化的Ⅰ型受体与特定的RSmad相互作用,并将其磷酸化。活化的RSmad与Co

8、Smad形成异聚复合体,并在核内积聚。核内的异聚复合体可以直接或者通过其他DNA结合蛋白间接与DNA结合,从而调节靶基因的转录。在Smad信号转导过程中也受到一些抑制信号的影响，如一种特异性的阻断Smad信号转导通路的肽适体——Trx2SARA[9],其关键作用是在BMP刺激时减少Smad2、Smad