叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究

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1、叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究【摘要】　　目的研究叶酸偶联牛血清白蛋白的合成工艺，制备包裹砒霜的白蛋白纳米粒并检验其对靶细胞的杀伤作用。方法叶酸在缩合剂的作用下与牛血清白蛋白偶联，通过正交设计选择最佳配方；用去溶剂法制备包裹砒霜的纳米粒，并观察其对靶细胞特异性杀伤作用。结果采用最佳条件合成的叶酸偶联牛血清白蛋白的偶联率为30.31μg/mg，纳米粒的砒霜包封率为10.3%，对靶细胞杀伤率为97%，对非靶细胞的杀伤力仅为23%。结论包裹有砒霜的叶酸偶联牛血清白蛋白纳米粒（简称F-BSANP）对靶细胞有特异性杀伤作用。【关键词】砒霜；纳米粒；叶酸；牛血清白蛋白　　Abstr

2、act：ObjectiveTostudythesyntheticprocedureoffolate-conjugatedbovineserumalbumin(F-BSA)andpreparationofalbuminnanoparticlesentrappingarsenictrioxide，andtoexaminethepeculiartoxicityofnanoparticlesontargetingcells.MethodsFolicacidalbuminviacondensingagent，ulaofF-BSAbytheorthogonaltestdesign．T

3、henanoparticlesethod，andthepeculiartoxicityofF-BSANPonA549adeinthebestformulag．TheentrappingrateofarsenictrioxideinedthepeculiartoxicityofF-BSANPontargetingcellsandcontrolgroupcells，respectively，andthedeathrateoftargetingcellsalbumin肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病，是导致残疾和早死的主要疾病之一。目前，临床使用的抗肿瘤化疗药物均有

4、较大的毒副作用，有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使用的直接原因。研究发现，在多种肿瘤细胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等)膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础［1］。　　中药砒霜（三氧化二砷）是中药中的传统毒药，近年来有关其抗肿瘤作用，尤其是在我国率先开展的三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)的研究引起了人们的广泛兴趣；研究已发现砒霜能显著抑制人肺癌的细胞生长并诱导其凋亡［2］。但是,在治疗过程中的严重毒副作用是影响其抗癌疗效的主要原因。本实验以传统中药砒霜为治疗药物，将其包裹在用叶酸偶联白蛋

5、白制成的纳米粒中，并进行其对靶细胞杀伤作用的研究。为以后制备其它抗癌药靶向制剂作铺垫。　　1材料人肺癌细胞株A549（购于武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心）；人骨髓间充质干细胞；分离自正常人骨髓血（骨髓血样由南昌大学医学院一附院血液科提供）；牛血清白蛋白（上海新量化工试剂有限公司）；叶酸（上海新量化工试剂有限公司）；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（简称EDC·HCl）（上海三杰生物技术有限公司）；SephadexG-25（Pharmacia）；三氧化二砷（购自上海化学试剂采购供应站，CP）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI164

6、0培养基（Gibco）；胰蛋白酶1∶250（Amresco）。　　2方法和结果　　2.1叶酸偶联白蛋白的合成　　2.1.1叶酸偶联白蛋白的合成与分离　　将叶酸溶于pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，加入EDC·HCl后搅拌活化5min，再加入50mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液，搅拌下反应数小时即得［3］。将反应液过SephadexG-25柱，收集前段淡黄色有乳光部分［4］。　　2.1.2因素和水平的确定　　经过查阅相关　　2.2纳米粒的制备　　2.2.1砷标准曲线的测定　　按新银盐法［5］测定并计算砷标准曲线，C=9.106A+0.9083，r=0.9939，RSD为

7、2.41%。在1～6μg浓度范围内，线性良好。　　2.2.2载药纳米粒的制备［6］　　As2O3溶于牛血清白蛋白溶液中，调节pH值微碱性，室温下缓缓加入无水乙醇，搅拌30min后再缓缓加入戊二醛溶液［7］，固化12h即得。制得包封率为10.3%的纳米粒。　　2.2.3包封率的测定　　取载药纳米粒用pH7.4的PBS分散，加入2.5%的胰蛋白酶消化2h，离心后取上清液新银盐法测定其吸光度A值，计算出砷含量。包封率（%）=纳米粒中所包裹的As2O3量投入As2O3的量×100%　　2.2.3空白回收率和加样回收率的测定　　经测定，